李绍辉,吴寒秋,许秀丽,章飞芳,冯　峰,张　峰,*,梁鑫淼

(1.华东理工大学药学院,上海 200237;2.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京 100176;3. 中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连 116023)



超高效液相色谱串联质谱法检测玛咖产品中非法添加西地那非

李绍辉1,2,吴寒秋2,许秀丽2,章飞芳1,*,冯峰2,张峰2,*,梁鑫淼1,3

(1.华东理工大学药学院,上海 200237;2.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,北京 100176;3. 中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连 116023)

建立了检测玛咖中西地那非的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法。色谱条件为Agilent SB-C18柱;柱温25 ℃;流动相为甲醇(10 mmol/L乙酸铵):水(10 mmol/L乙酸铵,m/V)(90∶10,v/v)等度洗脱;流速:0.3 mL/min;进样量:5 μL。质谱条件为正离子模式(ESI+),多反应监测模式(MRM);三重四级杆质量分析器;分子离子峰[M+H]+m/z 475.3,子离子为m/z 282.9,碰撞能50 eV;m/z 58.1 碰撞能为60 eV。西地那非在0.2～20 μg/L范围内线性关系良好,相关系数R2为0.9994。建立的方法准确可靠、灵敏度高,可应用于玛咖产品中西地那非的含量测定。

玛咖,西地那非,UPLC-MS/MS

玛咖(LepidiummeyeniiWalp)是十字花科独行菜属植物,原产秘鲁海拔3500 m以上的安第斯山区。营养物质丰富,具有缓解疲劳、改善睡眠、提升生育力和抗骨质疏松等功效[1-5]。玛咖营养价值丰富[6]可与人参相媲美,被称为“秘鲁人参”。我国卫生部在2002年正式批准玛咖进入中国,在云南等地开展引种种植。2011年卫生部公告第13号文件批准玛咖粉作为新兴资源食品。玛咖相关产品如玛咖片、玛咖酒、玛咖饮料、玛咖果糖等在保健品市场上有巨大的商业价值。

目前市场上玛咖产品琳琅满目,很多厂家宣传玛咖具有壮阳功效,称为“天然伟哥”[7]。然而近期新闻关于玛咖产品中添加西地那非(图1),欺骗消费者的报道越来越多[8]。西地那非是一种治疗男性勃起功能障碍药物,在中国市场上俗名称为“伟哥”。乱用西地那非会对人体造成诸多不良副作用,危害人身体健康。为了消费者的身体健康,对玛咖产品中非法添加西地那非的检测工作显得迫在眉睫。西地那非的检测方法有高效拉曼光谱法[9]、液相色谱法(HPLC)[10-11]和液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)[12-15],然而现在对玛咖产品中西地那非的检测研究却未见报道。玛咖产品成分复杂,添加西地那非含量低,使得检测难度增大。现有检测方法存在灵敏度低,前处理复杂,分析时间长等不足。本文建立以一种超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法,样品经甲醇提取、离心、定容、0.22 μm有机滤膜过滤,UPLC-MS/MS检测。该方法具有时间短、灵敏度高、准确度高等特点。可以应用于玛咖干果、玛咖精片、玛咖酒、玛咖饮料、玛咖果糖等玛咖产品中西地那非的检测,为人们选择玛咖产品提供参考。

图1　西地那非结构式Fig.1　Structural formula of sildenafil

1　材料与方法

1.1材料与仪器

西地那非标准品加拿大Toronto Research Chemicals(TRC),CAS号为171599-83-0,纯度为98%;乙腈、甲醇(色谱纯)德国Dr. Ehrenstorfer公司。甲酸、乙酸铵(色谱纯)美国Fisher公司。

丽江玛咖干果(黑色、紫色、黄色)丽江格林恒信玛咖销售有限公司;香格里拉玛咖干果(黑色、紫色、黄色)云南古之极营养品有限公司;会泽玛咖干果(黄色)云南购于昆明新螺蛳湾农贸市场;西藏玛咖干果(黑色、紫色)西藏劲草生物科技有限公司;秘鲁玛咖干果(黑色)秘鲁当地市场;玛咖酒浙江致中和实业有限公司(浙江,杭州);玛咖饮料云南天源化玛生物科技有限公司;玛咖精片西藏劲草生物科技有限公司;玛咖压片果糖威海紫光科技园有限公司。

1.2标准溶液的配制

精密称取西地那非标准品10 mg置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为1000 mg/L的标准品储备液。置于棕色试剂瓶中,4 ℃避光保存,保存期限3个月。

1.3样品处理

玛咖干果和玛咖精片,用粉碎机粉碎,过200目筛。称取样品粉末1 g,加入甲醇20 mL,超声10 min,离心(8000 r/min,5 min)。取上清液置于100 mL容量瓶中,加甲醇定容。提取液经0.22 μm有机滤膜过滤,作为样品溶液供LC-MS/MS测定。

玛咖酒和玛咖饮料,分别用移液枪精确取1 mL置于试管中,经氮气吹干,再分别用1 mL甲醇复溶。溶液经0.22 μm有机滤膜过滤,作为样品溶液供LC-MS/MS测定。

1.4测定方法

1.4.1色谱条件色谱柱:Agilent SB-C18柱(2.1×50 mm,1.8 μm);柱温25 ℃;流动相:甲醇(10 mmol/L乙酸铵):水(10 mmol/L乙酸铵,m/V)=90∶10等度洗脱;采集时间为2 min;流速:0.3 mL/min;进样量:5 μL。

1.4.2质谱条件电喷雾离子源(ESI),正离子模式(ESI+),多反应监测模式(MRM);三重四级杆质量分析器;毛细管电压:3500 V;碎裂电压(Fragment):380 V;干燥气温度:250 ℃,干燥气流量:14 L/min;鞘气温度:250 ℃,鞘气流量:11 L/min;碰撞池加速电压:3 V;喷嘴电压:2000 V。驻留时间(Dwell time)500 ms;分子离子峰[M+H]+475.3,子离子为:m/z 282.9,碰撞能50 eV;m/z 58.1 碰撞能60 eV。

1.5基质效应

取不同源玛咖样品5份,按照上述样品处理方法制备空白基质溶液。分别用纯溶剂和空白基质溶液配制相同浓度的西地那非两种检测液,在1、10、100 μg/L作为低、中、高3个添加浓度下对基质效应进行考察。按照上述分析方法进样检测,采用相对响应值法评价基质效应,按照公式(1)进行计算。

(1)

式中,Mi:基质溶液中西地那非的基质效应;Ami:基质中西地那非的色谱峰面积;Asi:纯溶剂中西地那非的色谱峰面积。

2　结果与讨论

2.1色谱条件优化

实验采用Agilent SB-C18超高效液相色谱柱,考察不同流动相对西地那非色谱分离的影响。分别用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相,有机相比例均为90%进行等度洗脱。结果发现,采用甲醇-水作为流动相色谱峰形很差,在水中加入0.1%的甲酸后信号响应增高,但色谱峰形没有明显改善。在水相中加入10 mmol/L的乙酸铵,信号响应和峰形都较好。当流动相用乙腈-10 mmol/L甲酸铵水溶液,色谱峰峰形平滑,响应增强。因此实验采用乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。

2.2质谱条件优化

三重四级杆质谱仪具有较好的灵敏度和抗干扰能力,适合于玛咖这样基质复杂的植物样品中添加西地那非的定量分析。采用电喷雾离子源(ESI),对比正负离子模式,结果表明西地那非在正离子模式下形成[M+H]+的准分子离子峰,响应较高。选择准分子离子m/z 475.3作为母离子,施加碰撞能对母离子打碎得到西地那非的二级质谱图,选择丰度较高的两个碎片离子m/z 58.1和282.9作为子离子,其中响应较高的碎片m/z 58.1作为定量离子。对碰撞能量进行优化使各子离子响应最高,由于西地那非结构较稳定,需要很高的碰撞能,子离子m/z 58.1和282.9碰撞能量分别为60 eV和50 eV。采用多反应监测模式(MRM)进行监测,液相接两通,采用单针进样的方式对质谱仪器参数进行优化。以响应值为参考,考察了驻留时间分别为50、100、200、300、400、500 ms时西地那非的响应。结果表明,随着驻留时间的增加响应随之增强,当驻留时间为500 ms时响应最高。对碰撞池加速电压进行优化,考察碰撞池加速电压分别为1、2、3、4、5 V时响应的变化,结果发现随着碰撞池加速电压的增高响应先增高后降低,当碰撞池加速电压为3 V时响应最高。对毛细管电压,喷嘴电压进行优化,电压增大响应增强,优化后的毛细管电压为3500 V,喷嘴电压为2000 V。实验还对干燥气流量、干燥气流速、鞘气流量、鞘气温度等参数进行了优化,使西地那非的响应最高。西地那非的一级和二级质谱图如图2和图3所示。

图2　西地那非一级质谱图Fig.2　MS spectrum of sildenafil

图3　西地那非二级质谱图Fig.3　MS2 spectrum of sildenafil

2.3基质效应

实验对玛咖基质效应进行考察,结果如表1所示,基质效应在72.97%～91.89%之间,RSD在0.46%～5.34%之间,结果表明,基质会对西地那非的检测产生抑制,使检测结果偏低。在中、高浓度时基质效应影响可以忽略,在低浓度时基质效应较大,应当对实验进行改进以减小基质效应的影响。因此实验使用空白基质加标的方法,减小基质效应对分析结果的影响。

表1　基质效应(n=3)

2.4方法学验证

2.4.1专属性取配制好的质量浓度为1 mg/L的标准储备液,分别用流动相和样品溶液稀释成质量浓度为100 μg/L的溶液,按照上述操作进行检测。结果表明,西地那非在玛咖基质溶液中色谱峰形良好,纯溶剂中西地那非保留时间为0.618 min,基质溶液中西地那非保留时间为0.603 min。西地那非在甲醇中与在玛咖提取液中的检测质谱TIC图如图4和图5所示。基质溶液中的物质对检测色谱条件的干扰可以忽略,表明该方法对玛咖中西地那非检测具有很好的专属性。

图4　甲醇中西地那非总离子流图Fig.4　Total ion chromatogram of sildenafil in methanol

图5　玛咖提取液液中西地那非总离子流图Fig.5　Total ion chromatogram of sildenafil in Maca extracts

2.4.2线性关系、检测限(LOD)和定量限(LOQ)为了减小基质效应的影响,用未检测到西地那非的玛咖样品作为空白,采用空白基质加标的方法做出基质匹配标准曲线用作定量。取质量浓度为1 mg/L的标准储备液,用基质溶液逐级稀释成质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、20 μg/L的标准液,按照上述分析条件进行检测。每个浓度的标准液重复进样3次,以定量离子峰面积(平均值)Y为纵坐标,西地那非的质量浓度X(μg/L)为横坐标进行回归运算。求得直线回归方程为Y=1355X+481.66,相关系数R2=0.9994。结果表明西地那非在0.2～20 μg/L范围内线性关系良好。

通过空白基质溶液稀释标准液进行检测,当色谱峰信噪比(S/N)等于3时对应的浓度作为方法的检测限,实验测得西地那非检测限为0.025 μg/L。配制浓度为0.5 μg/L的西地那非溶液5份,按照上述操作进行检测。按照上述标准曲线进行计算,求得该浓度下西地那非浓度的精密度(RSD)为1.32%<3%,将0.5 μg/L作为该方法的定量限。

2.4.3精密度取浓度为1 μg/L的西地那非溶液,重复进样6次,记录峰面积并计算相对标准偏差(RSD)。测得西地那非峰面积RSD为1.39%<2%,表明方法精密度良好。

2.4.4回收率应用本文建立方法,在空白玛咖样品中添加标准溶液,分别做0.05、0.1和1 mg/kg的3个水平的添加实验。每个添加水平做5个平行实验,按照1.3节所述的样品处理方法得到样品液进行测定,回收率结果如表2,西地那非平均回收率在92.45%～106.91%之间,相对标准偏差在4.98%～7.48%之间,该方法适合应用于玛咖中西地那非的定量分析。

表2　西地那非添加回收率和相对标准偏差(n=5)

2.4.5稳定性用基质溶液配制浓度为100 μg/L的标准液,分别在0、2、4、6、8、10 h检测,计算峰面积RSD以验证分析方法的稳定性,实验测定在不同时间进样西地那非峰面积RSD为1.78%,小于2%,方法具有良好的稳定性。

2.5实际样品分析

应用所建立的UPLC-MS/MS方法对市场上的玛咖果、玛咖酒、玛咖饮料、玛咖精片和玛咖果糖等共14个玛咖产品进行检测。测定这些玛咖产品中是否添加西地那非,并进行定量分析。检测结果表明所购买的样品均未检测出添加西地那非。

3　结论

本文建立了UPLC-MS/MS法对玛咖产品中非法添加西地那非进行检测。该方法具有高选择性、高灵敏度、准确定性定量分析等特点。样品前处理过程简单,节约时间和成本,可提高工作效率。可应用于玛咖产品中非法添加西地那非的定量分析,具有一定的实用价值。为检测玛咖产品质量的好坏、消费者身体健康提供方便。为规范市场上玛咖产品提供参考,具有很好的实用价值。

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Detection of sildenafil illegally added in maca products by liquid chromatography tandem mass spectrometry

LI Shao-hui1,2,WU Han-qiu2,XU Xiu-li2,ZHANG Fei-fang1,*,FENG Feng2,ZHANG Feng2,*,LIANG Xin-miao1,3

(1.School of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;2.Institute of Food Safety,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;3.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China)

The purpose was to establish a method for determination of sildenafil in Maca products by UPLC-MS/MS. The samples were separated on Agilent SB-C18 column(1.8 μm,2.1 mm×50 mm)and eluted using mobile phase of methanol(10 mmol/L ammonium acetate):water(10 mmol/L ammonium acetate)(90∶10,v/v)at a flow rate of 0.3 mL/min,the injection volume was 5 μL. MS condition was positive ion mode,collecting multiple reaction monitoring(MRM)mode. Precursors to product ion transitions of m/z 475.3>58.1 was to quantify sildenafil,and m/z 475.3>282.9 was used as qualifying ion for sildenafil. The collision energy was 50 and 60 eV,respectively. The method was linear in the concerntration range of 0.2～20 μg/L,and the correlation coefficient was 0.9994. The method was accurate,reliable and highly sensitive,and hence it can be applied in the determination of sildenafil in Maca products.

Maca;Sildenafil;UPLC-MS/MS

2015-11-19

李绍辉(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：中药学，E-mail：shaohui_L@126.com。

章飞芳(1975-)，女，博士，副研究员，研究方向：药物分离分析方法研究，E-mail:zhangff@ecust.edu.cn。

张峰(1974-)，男，博士，研究员，研究方向：分析化学，E-mail：fengzhang@126.com。

国家重大科学仪器设备开发专项项目(2012YQ14000806)；质检公益性项目(201310134)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)11-0310-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.055