高　林,高文惠，*

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050000;2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄 050000)



四环素分子印迹电化学传感器的制备及快速检测牛奶和猪肉中四环素类药物残留

高林1,2,高文惠1,2，*

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050000;2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄 050000)

以四环素(TC)为模板分子,邻苯二胺(OPD)为功能单体,在磷酸缓冲液中采用电聚合的方法在玻碳电极表面制备了能够特异识别模板分子及其结构类似物的分子印迹电化学传感器。实验选用含1 mol/L KCl及5 mmol/L K3[Fe(CN)6]的HAc-NaAc缓冲液为表征溶液,应用差分脉冲伏安法(DPV)和循环伏安法(CV)研究了传感器的电化学响应特性,并优化制备与检测条件。结果表明,在最佳条件下,DPV峰值电流差与四环素及其结构类似物土霉素和盐酸强力霉素在0.002～0.02 mmol/L 浓度范围内线性关系良好,检出限在6.0×10-7～7.5×10-7mol/L之间。传感器在H2SO4-甲醇混合液中可再生,且具有良好的稳定性,对四环素以及结构类似物具有良好的选择性。采用该传感器对实际样品牛奶和猪肉中四环素、土霉素和盐酸强力霉素进行检测,加标回收率在82.8%～97.4%之间,相对标准偏差(RSD)≤4.43%。该传感器操作简便、检测快速灵敏、成本低,稳定性好,有良好的应用前景。

四环素,分子印迹聚合物,电化学传感器,快速检测

四环素类抗生素可利用放线菌发酵或半合成的方法生产,是一类广谱抑菌剂,高浓度时具有杀菌作用,对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有较好的抑制和杀灭效果。四环素类药物不仅可以作为兽药对畜禽类、鱼类疾病起到预防及治疗的作用,而且可以作为饲料添加剂促进畜禽成长,因此被广泛应用于畜禽、水产养殖业中[1]。而四环素类药物滥用,会在动物源食品中造成残留,引起人体过敏性反应和抗药性等。因此,食品中四环素类药物残留检测引起人们关注。

目前,检测四环素类药物残留的方法主要包括高效液相色谱法[2-3]、高效液相色谱-质谱联用法[4-5]、微生物法[6]、免疫法[7]、毛细管电泳法[8]等。色谱及色谱-质谱联用方法是目前检测四环素最常用的方法,但该方法仪器昂贵、样品处理要求高,需要专业操作人员;微生物法可以实现大量样品的检测,但假阳性几率较大且耗时长,不适合定量分析;免疫分析法检测快速,适合现场检测,但生物性抗体不稳定,重现性较差;毛细管电泳法分离效率高,样品处理简单,但重现性较差,灵敏度较低。

分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer,MIP)具有较高的灵敏度、较强的抗干扰能力、良好的稳定性以及较强特异性识别能力,在电化学传感器的制备方面得到广泛的应用[9]。基于分子印迹聚合物膜的电化学传感器不仅具有MIP的优点,而且具有造价低廉、操作简单、响应快速以及易于实现自动化等优势,近年来得到人们的广泛关注。有关四环素分子印迹电化学传感器的研究虽已有报道[10-11],但主要是关于传感器制备和性能研究或针对模板物质的测定,而对其结构类似物的测定鲜有报道。本研究电聚合邻苯二胺,并优化制备与检测条件,制备了检测四环素及其结构类似物的分子印迹电化学传感器。该传感器选择性好,灵敏度高,响应迅速,在食品安全快速检测中有良好应用前景。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

伊利纯牛奶,猪后座肉均为市售。

LK98BII型电化学工作站天津市兰立科化学电子高技术有限公司;三电极系统(CHI104玻碳电极(直径3 mm),CHI115铂丝电极,CHI111 Ag/AgCl电极)、抛光材料(氧化铝粉、麂皮)天津艾达恒晟科技发展有限公司。

四环素(TC)纯度98%,土霉素纯度98%,安徽酷尔生物工程有限公司;邻苯二胺(OPD)纯度98%,盐酸强力霉素纯度98%,氯霉素纯度98%,阿拉丁试剂有限公司;K3[Fe(CN)6]、氯化钾、甲醇、浓硫酸、醋酸钠、冰乙酸、无水乙醇、高氯酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠均为分析纯,实验用水为超纯水。

1.2玻碳电极的预处理

将玻碳电极(GCE)依次用0.5、0.3、0.05 μm粒度的α-Al2O3粉在麂皮表面研磨抛光成镜面,用超纯水冲洗干净后再依次于0.5% HNO3、超纯水、无水乙醇中超声清洗(每次5～6 s)1 min;氮气吹干,再将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中,采用电化学方法对电极进行活化处理,以达到电极最佳状态,取出电极再次用超纯水冲洗后氮气吹干;然后将其置于表征溶液(1 mol/L KCl及5 mmol/L K3[Fe(CN)6]的HAc-NaAc缓冲液)中采用循环伏安法循环扫描。重复以上操作直至对电极表征得到对称且可逆的氧化还原峰,峰电位差在85 mV以下,最后取出电极待用[12]。

1.3四环素分子印迹及非分子印迹电化学传感器的制备

称取0.0086 g邻苯二胺(OPD)溶于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)中,加入2 mL 10 mmol/L四环素溶液混合均匀,超声10 min,通氮气除氧5 min。将三电极体系置于配制好的含有TC与OPD的磷酸缓冲液,采用循环伏安法扫描15圈,扫描电位为0～0.8 V,扫描速度为50 mV/s,在玻碳电极表面得到一层致密的不导电的聚合物薄膜,氮气吹干,即制得嵌有四环素分子的印迹聚合物膜电极(TC-MIP-OPD/GCE),将此电极置于0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)溶液中浸泡10 min,洗脱掉镶嵌在聚合物薄膜内的四环素模板分子,即成功制得对四环素分子敏感的印迹聚合物膜电极(MIP-OPD/GCE)。非分子印迹聚合膜电极(NMIP-OPD/GCE)的制备除不添加模板分子四环素外,其他条件均与印迹电极的制备完全相同。

1.4电化学测量

实验过程中,在室温下用CV和DPV法优化实验条件并表征电化学传感器性能,将三电极系统置于含电活性探针K3[Fe(CN)6]的溶液中测量电极的电流响应。设定测量参数如下:CV,扫描电位和扫描速率分别为-0.3～0.7 V和50 mV/s;DPV,起止电位为-0.2～0.6 V、电位增量0.004 V、脉冲宽度0.05 V、脉冲幅度0.05 V、脉冲间隔0.1 s。每次测量后,将工作电极浸泡在0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)溶液中洗脱,除去模板分子后用超纯水冲洗电极,氮气吹干,再进行下一次测量。

1.5线性关系和检出限

配制不同浓度的四环素标准溶液(0.0002～0.08 mmol/L),采用DPV对洗脱后的分子印迹聚合物膜电极在空白溶液与配制好的不同浓度四环素标准溶液吸附后的电流响应进行测定,以ΔI为纵坐标,以四环素标准溶液浓度为横坐标,作图得出二者线性范围,以S/N=3确定目标物质的检出限。用上述同样方法研究传感器对土霉素和盐酸强力霉素标准溶液检测的线性关系和检出限。

1.6样品处理

牛奶样品的前处理:取5 mL市售纯牛奶置于50 mL离心管中,加入10 mL 5% Na2EDTA-McIlvaine提取剂,振荡混匀2 min,超声提取10 min,4000 r/min离心10 min,取上清液,残渣再次加入10 mL提取剂按上述方法处理,合并两次上清液,并用提取剂定容至25 mL,过膜待用。

猪肉样品的前处理:取5 g市售猪肉,切碎后置于三角瓶中,加入5% HClO4溶液20 mL,振荡混匀,超声提取10 min后移入50 mL离心管中,4000 r/min离心10 min,取上清液,残渣再次加入15 mL提取剂按上述方法处理,合并两次上清液,浓缩后用提取剂定容至25 mL,经0.45 μm滤膜过滤待用[12]。

2　结果与讨论

2.1四环素分子在裸玻碳电极上的电化学行为

四环素电活性的大小影响到其检测方法的选择,若四环素分子电活性较强则可采用电化学方法直接对其进行检测,否则采用电化学的方法对其进行检测很难实现。实验考察了四环素的电活性,图1为1 mmol/L四环素分子在裸电极上循环伏安曲线图。由图可以看出,在聚合前2圈时循环伏安曲线出现并不明显的氧化与还原峰,随后逐渐消失,表明四环素电活性较小,且在聚合电位下分解成非电活性的物质,因此不宜直接采用电化学的方法对四环素分子进行检测。因此实验采用通过制备四环素分子印迹电化学传感器间接对四环素类药物进行检测。

图1　四环素在PBS缓冲液(pH7.2)中的循环伏安曲线Fig.1　Cyclic voltammograms for 1 mmol/L TC on GCE in PBS(pH7.2)

2.2功能单体的选择

实验采用电聚合的方法制备四环素分子印迹聚合物膜电极。电聚合是一种利用电化学方法促使功能单体在电极表面直接进行聚合的方法,可利用此类方法进行聚合的功能单体范围较广[13]。实验依据模板分子与功能单体以氢键键结合的原则进行功能单体的筛选,邻苯二胺和吡咯作为此类功能单体成功用于实验的报道较多[14-16]。

实验研究了目前较常用的邻苯二胺作为功能单体进行电聚合的性质。聚合曲线如图2所示。

图2　邻苯二胺在磷酸缓冲液中(pH7.2)电聚合曲线Fig.2　Cyclic voltammograms of OPD electropolymerization in PBS(pH7.2)

将覆盖有邻苯二胺聚合薄膜的玻碳电极置于经除氧处理的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.2)中浸泡10 min后,用超纯水冲洗,氮气吹干,对电极进行表征。结果在表征电位-0.3～0.7 V范围内没有氧化还原峰出现,且电流强度几乎为零,表明邻苯二胺聚合膜在该酸性环境下稳定,适用于电极的修饰,因此,本实验选择OPD为电聚合的功能单体。

2.3电聚合制备四环素分子印迹膜

以OPD为功能单体,在模板分子TC存在的情况下,玻碳电极上OPD电聚合过程的CV曲线如图3所示。由图可以看出在0.39 V处出现一个明显的氧化峰,且在聚合的第2圈电流值骤减,并且随着CV扫描圈数的增加,电流强度逐渐降至接近于0,表明随着电聚合的进行玻碳电极表面逐渐覆盖了一层不导电的薄膜,聚合液中OPD无法进一步氧化,电流响应也受到抑制。与图2相比,图3未见显著差异,表明OPD的电聚合不会因为TC的存在而受到干扰。

图3　4 mmol/L四环素存在情况下OPD在磷酸缓冲液中(pH7.2)电聚合曲线Fig.3　Cyclic voltammograms of OPD electropolymerization in PBS(pH7.2)under the presence of 4 mmol/L tetracycline

2.4洗脱剂及洗脱时间的选择

实验分别考察了乙醇-水(1∶1,v/v)、0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)、0.5% HNO3作为洗脱剂时,对聚合物薄膜中模板分子的洗脱效果。结果发现0.5% HNO3、乙醇-水(1∶1,v/v)不能将模板分子洗脱,或对模板分子洗脱效果不佳;而采用0.5 mol/L H2SO4-甲醇(1∶5,v/v)为洗脱剂时,洗脱效果良好。

随后,实验对最佳洗脱时间做了考察,对比了TC-MIP-OPD和NMIP-OPD,在相同洗脱条件下,随洗脱时间的增加,二者响应电流的变化规律。结果如图4所示。从图中可以看出,NMIP-OPD在洗脱过程中始终无电流响应;TC-MIP-OPD随洗脱时间的延长,响应电流值逐渐增大,表明TC-MIP-OP中模板分子逐渐被洗脱,印迹空穴增多,电活性探针透过空穴到达电极表面产生响应电流逐渐增大,当洗脱时间为10 min时,峰电流值达到平衡。因此,选择10 min作为最佳洗脱时间。

图4　响应峰电流随模板分子洗脱时间的变化Fig.4　The change of response current alongwith the elution time of template molecules

2.5吸附时间的确定

吸附时间是评价传感器性能的一个重要的依据,选取1 mmol/L的四环素溶液做静置吸附实验,采用DPV,每2 min即在探针溶液中测量一次,峰值电流变化如图5所示。由图可以看出,吸附时间在8 min前,随着吸附时间的增加,峰电流值逐渐下降,表明随着空穴被模板分子重新占据,与电极表面接触的电化学活性探针的量逐渐减少,当吸附时间超过8 min后,峰电流值达到平衡。因此,8 min为最佳吸附时间。

图5　响应峰电流随吸附时间的变化Fig.5　The change of response current alongwith adsorption time

2.6分子印迹效应

实验分别采用CV和DPV两种方法在探针溶液中对不同电极进行表征,图6和图7中表征曲线显示了电流响应变化情况。由图6中DPV表征曲线可知裸电极(曲线a)峰电流值较大,说明探针离子几乎没有阻碍的在裸电极发生氧化还原反应;而分子印迹聚合物膜电极未洗脱模板分子(曲线d)时,在电极表面几乎没有电流响应,这说明附着在电极表面的聚合物膜不导电,且阻碍了电活性探针离子向电极表面的传递,抑制了氧化还原反应;分子印迹聚合物膜电极洗脱模板分子后(曲线b),峰值电流较洗脱前有大幅度提高,这是由于分子印迹聚合物膜上模板分子被洗脱后,探针离子可通过印迹空穴与电极表面接触,发生电化学反应;电极洗脱模板分子后再吸附(曲线c)与曲线b相比较,峰值电流下降,说明再吸附后,分子印迹聚合物膜上的空穴一部分被模板分子占据,探针离子通过膜的数量减少,响应电流强度减小。CV(图7)和DPV表征效果一致。

图6　不同电极在表征溶液(pH3.2)中差分脉冲伏安图Fig.6　Differential pulse voltammograms of different electrodes in the characterization solution(pH3.2)

图7　不同电极在表征溶液(pH3.2)中循环伏安图Fig.7　Cyclic voltammograms of different electrodes in the characterization solution(pH3.2)

2.7分子印迹聚合物膜的选择性研究

选择盐酸强力霉素、土霉素、氯霉素作为干扰物质对分子印迹聚合膜电极进行选择性研究,采用DPV考察了分子印迹聚合膜电极对于相同浓度(0.01 mmol/L)下四环素及干扰物质的电流响应,计算相对峰值电流变化(Δi)情况,Δi表示分子印迹聚合物膜吸附目标物质前后峰值电流的差值,Δi越大,表明传感器对目标物质选择性越高。实验结果如图8所示,该传感器对模板分子四环素电流响应值最大,其次是其结构类似物盐酸土霉素、盐酸强力霉素,而对氯霉素响应很微弱。这是由于盐酸土霉素和盐酸强力霉素在分子结构上与四环素较为相似,因此可以进入到印迹空穴中与功能单体结合,说明该传感器能够对四环素及其结构类似物进行测定;而氯霉素与模板分子的结构差异较大,所以传感器对氯霉素选择性较差,即氯霉素分子不会进入到印迹空穴中对四环素的测定形成干扰。由此可见,该传感器选择性好。

图8　分子印迹聚合膜电极的选择性Fig.8　Selectivity of the imprinted electrode 注:A:四环素;B:盐酸强力霉素;C:土霉素;D:氯霉素。

2.8线性关系与检出限

表1　三种四环素类药物分子的线性关系及检出限

表2　样品的回收率和精密度(n=5)

按照1.5方法研究目标物质的线性范围与检出限,结果如图9～图11所示。结果表明,3种四环素类药物在一定浓度范围内与ΔI均呈线性关系,其线性方程、线性相关系数以及检出限如表1所示。由表1可以看出,该传感器线性关系良好,灵敏度高。

图9 　不同浓度的四环素标准溶液差分脉冲伏安图Fig. 9　Differential pulse voltammograms of the different concentration tetracycline standard solutions

图10　不同浓度的土霉素标准溶液差分脉冲伏安图Fig.10　Differential pulse voltammograms of the different concentration terramycin standard solutions

图11　不同浓度的盐酸强力霉素标准溶液差分脉冲伏安图Fig.11　Differential pulse voltammograms of the different concentration doxycyclinehydrochloride standard solutions

2.9实际样品的测定

牛奶和猪肉样品按1.6方法处理,取过膜后待用液各2 mL分别置于电解杯中,并用醋酸缓冲液稀释至10 mL作为待测样品溶液。采用本实验中1.5电化学测量方法对样品进行检测,检测结果为样品中未检出四环素及其结构类似物。

2.10回收率和精密度实验

取上述阴性样品进行高、低水平的添加回收率实验。每个水平均做5次平行实验,采用DPV进行测定,结果如表2所示。由表2可以看出,样品中3种四环素类药物的平均回收率(AR)在82.8%～97.4%,相对标准偏差(RSD)≤4.43%。

2.11传感器重现性与稳定性

实验对该传感器重现性进行了研究,同样条件下使用传感器20次,所得ΔI的RSD≤6.42%(n=20),传感器性能基本无衰减,表明该传感器重现性好。以四环素为例对传感器进行稳定性研究,将电极在4 ℃下保存,一周后用传感器在最佳检测条件下对0.01 mmol/L四环素标准溶液进行测定,其响应值为初始值的95.3%,两周后其响应值为初始值的90.1%,三周后其响应值为初始值的88.5%,四周后其响应值为初始值的84.6%,表明该传感器的稳定性好。

3　结论

实验采用电聚合邻苯二胺的方法制备了一种具有特异识别性的分子印迹电化学传感器,并采用CV和DPV研究了传感器的电化学响应并优化制备条件,研究了传感器印迹效应及选择性。实验对实际样品中模板物质及其结构类似物均做了加标回收率及精密度实验。结果表明,该传感器可用于食品中四环素及其类似物的检测,且传感器选择性及稳定性良好,抗干扰能力强。

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Preparation of tetracycline moleculary imprinting electrochemical sensor and rapid detection of tetracycline residues in milk and pork

GAO Lin1,2，GAO Wen-hui1,2，*

(1.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050000,China;2.Center for Fermentation Engineering of Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China)

A novel molecular imprinted electrochemical sensor was prepared by electro-polymerization on the surface of a glassy carbon electrode in phosphate buffer solution,and tetracycline was used as template moleculer,o-phenylenediamine(OPD)as functional monomer. The sensor could specifically recognize the template molecule and its analogues. In the experiment,the HAc-NaAc buffer solution containing 1 mol/L KCL and 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]was used as characterization solution,the electrochemical sensor response characteristics were researched,and the preparation and detection conditions of the sensor were optimized by differential pulse voltammetry(DPV)and cyclic voltammetry(CV). The results showed that the sensor had a good selectivity under the optimal conditions,the linear relationships between DPV peak current difference and the concentrations of tetracycline,oxytetracycline and doxycycline hyclate were found in the range of 0.002～0.02 mmol/L with the detection limits between 6.0×10-7and 7.5×10-7mol/L. The sensor in methanol-H2SO4solution was renewable,and had good reproduction,stability and good selectivity to tetracycline and its analogues. The tetracycline,oxytetracycline and doxycycline in real samples,such as milk and pork,were detected by the sensor,the average recoveries were between 82.8% and 97.4%,the relative standard deviations(RSD)were less than 4.43%. This sensor was simple,sensitive,low cost,and had a good stability,which provided it a good application prospect.

tetracycline;molecular imprinting polymer;electrochemical sensor;rapid detection

2015-11-05

高林(1990-)，男，在读研究生，主要研究方向：食品安全与检测，E-mail：13933859737@163.com。

高文惠(1963-)，女，博士，教授，研究方向：食品安全控制技术与检测技术，E-mail：wenhuigao@126.com。

河北省科技计划项目(16275503D)；河北省食品药品监督管理局食品药品安全科技计划项目(ZD2015015)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)11-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.053