陈俭清,高凌飞,任涌志,盛尊来,姜　岩,高　利,李艳华

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨 150030)



响应面法优化丁香叶总皂苷提取工艺

陈俭清,高凌飞,任涌志,盛尊来,姜岩,高利,李艳华*

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨 150030)

采用响应面分析法对丁香叶总皂苷提取工艺进行优化。以总皂苷提取率为考察指标,在单因素实验基础上,采用响应面分析法对乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间进行优化。结果表明,乙醇回流提取总皂苷的最佳工艺条件为:乙醇浓度82%、液料比25∶1 mL/g、提取温度85 ℃、提取时间116 min、提取次数2次,在此条件下总皂苷提取率为(69.655±0.0145) mg/g,与理论值仅相差0.461 mg/g,表明此模型准确可靠,是提取丁香叶总皂苷的可行方法。

丁香叶,总皂苷,响应面,提取工艺

丁香叶为木樨科(Oleaceae)丁香属(Syringa)紫丁香的干燥叶片。我国是丁香的栽培起源中心,种质资源丰富,丁香属植物约有32种,我国产27种,其中特有种22种,而欧洲仅产2种,亚洲其它国家和地区(如日本、朝鲜、尼泊尔、巴基斯坦、阿富汗等)产4种,美洲则完全没有。药用价值早为民间所认知,其水煎剂用于治疗暴火眼和痢疾。对丁香叶大量研究发现,其具有抗菌、抗病毒、清热、燥湿、抗氧化、解毒、消炎和麻醉等作用。通过对丁香叶化学成分进行研究发现,丁香叶含有多种活性成分,例如:有机酸类、挥发油、总黄酮、总酚酸和总皂苷等成分[1-3],而目前对于丁香叶成分研究主要集中在前几种物质上,对总皂苷的研究较少。

皂苷类物质具有抗菌、抗氧化、免疫系统的双向调节、抗疲劳、抗癌、降血糖、抗艾滋病毒等药物活性,此外总皂苷还可以用于高级化妆品、化工原料和食品添加剂中[4-5]。丁香叶中含有丰富的皂苷类物质,而且与丁香叶的多种活性功能有关[3]。为了使丁香叶更广泛的应用于功能性食品的开发,本实验在原有丁香叶总皂苷提取工艺研究基础上[3],采用响应面(response surface methodology,RSM)分析法对丁香叶总皂苷的提取方法进行优化,优选出丁香叶总皂苷最佳提取方法和工艺[6],旨为丁香叶的综合开发利用提供一定理论参考。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

丁香叶采自东北农业大学校园内,经黑龙江省中医药大学李彦冰教授鉴定为丁香叶,采收期为2013年9月;齐墩果酸标准品上海金穗生物科技有限公司(纯度≥98%);乙醇等试剂均为分析纯试剂。

UV-8000A紫外分光光度计上海市元析仪器有限公司;DH6000A电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司;CPA225D分析天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;KQ3200E型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1丁香叶总皂苷提取将丁香叶叶片打碎,粗粉粒径过2#药筛,不过3#药筛,称取丁香叶粗粉5.0 g,置250 mL圆底烧瓶中,乙醇回流法提取,提取液抽滤后,合并提取液,采用旋转蒸发仪浓缩,定容至100 mL容量瓶中,备用[5]。

1.2.2波长的选择精密称取干燥至恒重的齐墩果酸标准品11.04 mg置于25 mL容量瓶中,加入甲醇5 mL,超声处理5 min,用甲醇定容至刻度,其浓度为0.44 mg/mL,以其作为标准品储备液。吸取齐墩果酸标准品溶液0.05 mL及供试品溶液1 mL于10 mL具塞试管中,水浴挥干溶剂,精密加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,加塞,摇匀,于60～65 ℃水浴中加热15 min,取出,流水冷却至室温后,加入冰乙酸5 mL,摇匀,在450～900 nm波长范围内扫描。确定测定波长[3]。

1.2.3标准曲线的制备精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL分别加入5支具塞试管中,即各试管中标准品浓度分别为0.044、0.066、0.088、0.110、0.132 mg/mL,按照“1.2.2”项下操作,测定吸光度[3]。

1.2.4丁香叶总皂苷提取单因素实验分别考察乙醇浓度、液料比、提取温度、提取时间和提取次数5个因子对丁香叶总皂苷提取率的影响[6]。

1.2.4.1乙醇浓度对丁香叶总皂苷提取率的影响当提取温度60 ℃、时间1 h、液料比20∶1(mL/g)、提取次数为1次时,考察0、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液对丁香叶总皂苷提取率的影响。

1.2.4.2液料比对丁香叶总皂苷提取率的影响当乙醇浓度80%、提取时间1 h、温度60 ℃、提取次数为1次时,考察20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1的液料比对丁香叶总皂苷提取率的影响。

1.2.4.3提取温度对丁香叶总皂苷提取率的影响当乙醇浓度80%、时间1 h、液料比30∶1、取次数为1次时,考察50、60、70、80、90、100 ℃的温度对丁香叶总皂苷提取率的影响。

1.2.4.4提取时间对丁香叶总皂苷提取率的影响当乙醇浓度80%、温度80 ℃、液料比30∶1、提取次数为1次时,考察30、60、90、120、150、180 min对丁香叶总皂苷提取率的影响。

1.2.4.5提取次数对丁香叶总皂苷提取率的影响当乙醇浓度80%、提取时间120 min、温度80 ℃,液料比30∶1时,考察提取次数1、2、3、4次对丁香叶总皂苷提取率的影响。

1.2.5响应面实验设计提取次数为2次时,总皂苷提取率较高,因此确定提取次数为2次的前提下,采用统计分析软件Design-Expert 8.0.6,根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理,基于单因素实验结果,以乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为自变量,丁香叶总皂苷提取率(Y)为响应值,采用四因素三水平的响应面分析法进行实验设计,因素水平设计见表1[6-13]。

表1　丁香叶总皂苷提取响应面分析实验设计因素与水平表

1.2.6总皂苷提取率的计算

总皂苷提取率(mg/g)=提取液中有效成分的浓度×提取液的终体积/原药材的质量[6]

1.3数据处理

所有数据均为3次重复实验的平均值,单因素实验数据运用Origin7.5软件绘制趋势曲线图;响应面实验采用Design-Expert 8.0.6软件进行。

2　结果与分析

2.1测定波长和标准曲线的确定

2.1.1测定波长的确定齐墩果酸对照品在553 nm处有最大吸收,样品溶液在546 nm处有最大吸收,但在553 nm处也有强吸收,故选择553 nm为测定波长。

2.1.2标准曲线的确定通过对标准品齐墩果酸的测定,得到吸光度与浓度的方程:A=4.9364C-0.0436,r=0.9996,在0.044～0.132 mg/mL范围内齐墩果酸对照品显色后的吸光度与浓度呈良好线性关系。

2.2单因素实验

2.2.1乙醇浓度对丁香叶总皂苷提取率的影响由图1可看出,随乙醇浓度的升高,总皂苷提取率呈现出先上升后下降的趋势,当乙醇浓度为80%时提取率最大,即80%乙醇有利于丁香叶中总皂苷类物质的溶出。将80%定为乙醇浓度优化的中心点。

图1　乙醇浓度对总皂苷提取率实验的影响Fig.1　Effects of ethanol concentration on total saponins extraction rate

2.2.2液料比对丁香叶总皂苷提取率的影响由图2可看出,随液料比增加,总皂苷提取率呈先升高后降低的趋势,当液料比为30∶1时达到峰值。溶剂量的增加使物料与溶剂接触面积、溶剂传质推动力均增大,浓度梯度变大,有利于总皂苷的溶出,从而使其溶出速度和提取率变大。当液料比一定时,提取率最高,随着液料比继续增加,溶剂体积增加使得物料吸附溶剂的量也逐渐变大,从而导致总皂苷被物料吸附而不易溶出[11]。将液料比30∶1定为液料比优化的中心点。

图2　液料比对总皂苷提取率的影响Fig.2　Effect of liqued/material ratio on total saponins extraction rate

2.2.3提取温度对丁香叶总皂苷提取率的影响由图3可看出,随着温度升高总皂苷提取率也逐渐升高,这是由于温度升高有助于传质过程,使分子扩散运动激烈,加快溶质的扩散和溶剂的渗透,有利于总皂苷类物质的溶出。在80 ℃时提取率最高,90 ℃时提取率下降,是由于该温度可能使部分结构不稳定的总皂苷类物质被破坏[3,13]。因此将80 ℃定为温度优化的中心点。

图3　提取温度对总皂苷提取率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on total saponins extraction rate

2.2.4提取时间对丁香叶总皂苷提取率的影响由图4可看出,随着提取时间的延长,总皂苷提取率迅速上升,在120 min时提取率达到最高,随着提取时间延长,提取率开始下降,这可能是由于总皂苷类物质发生了氧化和降解等反应[3,10,13]。将120 min定为提取时间的优化中心点。

图4　提取时间对总皂苷提取率的影响Fig.4　Effect of extraction time on total saponins extraction rate

2.2.5提取次数对丁香叶总皂苷提取率的影响由图5可看出,随着提取次数大于2次时,总皂苷的提取率没有发生明显的改变,而且提取次数越多,将会给浓缩带来影响,并造成大量人力、动力和溶剂等的浪费[6]。因此提取次数的最佳工艺确定为2次。

图5　提取次数对实验的影响Fig.5　Effect of extracting times on total saponins extraction rate

2.3丁香叶总皂苷提取工艺优化

2.3.1数学模型的建立与检验基于单因素实验,采用响应面法对丁香叶总皂苷的提取工艺进行优化,以乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)和提取时间(D)为自变量,丁香叶总皂苷提取率(Y)为响应值,根据Box-Behnken的实验设计原理,得出丁香叶总皂苷提取率的四因素三水平的实验设计结果(见表2)。采用Design expert8.0.6统计分析软件,对表2数据进行了多元回归拟合,得下列函数关系:Y=66.76+1.45A-1.2B+0.39C-2.05D+0.97AB+1.52AC+(2.500E-003)AD-3.22BC+(5.000E-003)BD+1.76CD-6.47A2+0.21B2-3.72C2-4.12D2

表3　方差分析结果

注:*:差异性显著p<0.05,**:差异性极显著p<0.01。

对该模型进行显著性分析检验,得方差分析表(表3)。由表3可知,方程总模型和方程二次型p=0.0107<0.05,表明该模型显著,对丁香叶总皂苷提取率的影响显著;回归失拟项p=0.0993>0.05,表明未知因素对该实验的影响较小。除提取时间外,其余三个因子对总皂苷提取率的影响均不显著,由F值可得各因素对丁香叶总皂苷提取率的影响顺序为:提取时间>乙醇浓度>液料比>提取温度;其中交互项影响均不显著；二次项影响:B2影响不显著,C2影响显著,A2、D2影响极显著。

2.3.2丁香叶总皂苷提取工艺条件的优化由该软件优化的最佳工艺条件为:乙醇浓度81.84%、液料比25.00∶1、提取温度84.70 ℃、提取时间115.55 min、提取2次。考虑到实际操作,将以上理论组合校正为:乙醇浓度82%、液料比25∶1、提取温度85 ℃、提取时间116 min、提取次数2次。进行3次验证实验,得到总皂苷提取率为(69.655±0.0145) mg/g,接近预测值69.194 mg/g,表明该工艺优化合理。

表2　丁香叶总皂苷提取响应面实验设计及结果

3　结论

将响应面分析法用于丁香叶总皂苷提取工艺参数优化,确定的最佳提取工艺为:乙醇浓度82%、液料比25∶1、提取温度85 ℃、提取时间116 min、提取2次。在此条件下丁香叶总皂苷提取率为(69.655±0.0145) mg/g,与理论值接近,表明此优化工艺可为进一步开发功能性食品提供可靠依据。

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Optimization of extraction process of total saponins fromSyringaoblateLindl. leaves by response surface methodology

CHEN Jian-qing,GAO Ling-fei,REN Yong-zhi,SHEN Zun-lai,JIANG Yan,GAO Li,LI Yan-hua*

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Total saponins extraction fromSyringaoblateLindl. leaves was performed using the ethanol reflux extraction. Response surface methodology(RSM),based on a three level,four variable Box-Behnken design(BBD),was employed to obtain the best possible combination of ethanol concentration,liqued/material ratio,extraction temperature and extraction time. The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration of 82%,liqued/material ratio of 25∶1 mL/g,extraction temperature of 85 ℃,extraction time of 116 min and extraction times of 2. Under these conditions,the experimental yield was(69.655±0.0145) mg/g. The difference of extract rate between actual value and theoretical value was 0.461 mg/g,therefore the extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable,accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total saponins fromSyringaoblateLindl. leaves.

SyringaoblateLindl. leaves;total saponins;response surface methodology(RSM);extraction process

2015-07-21

陈俭清(1982-)，男，硕士，实验师，研究方向：动物药学，E-mail:chen-jianqing@hotmail.com。

李艳华(1970-)，女，博士，教授，研究方向：病原微生物耐药性研究及新兽药研发，E-mail:Liyanhua1970@163.com。

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12543021)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)10-0320-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.057