神秘果种子多糖的响应面优化提取及其抗氧化活性研究

2016-09-10马艺丹马思聪闫瑞昕薛炳祥

食品工业科技 2016年10期

关键词：吸光清除率超声波

马艺丹,刘　红,2,*,马思聪,闫瑞昕,薛炳祥,王　茜

(1.海南师范大学化学与化工学院,海南海口 571127; 2.热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室,海南海口 571127)

神秘果种子多糖的响应面优化提取及其抗氧化活性研究

马艺丹1,刘红1,2,*,马思聪1,闫瑞昕1,薛炳祥1,王茜1

(1.海南师范大学化学与化工学院,海南海口 571127; 2.热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室,海南海口 571127)

神秘果种子,多糖,抗氧化,提取,响应面分析

神秘果(Synsepalumdulcificum)属山榄科,又称变味果或蜜拉圣果,是一种天然的药食同源植物,原产于西非热带地区,如今在中国海南、云南、广西等省份也大面积种植[1]。据报道,除了神秘果种子含有的神秘果素能改变人的味觉,其种子可以促进胰岛素分泌[2],是用于治疗糖尿病、高血压的天然药物[3]。种子里还含有天然固醇和一些微量矿物元素[4],以及大量的多酚类物质[5]。目前,国内外对神秘果种子都有研究,但主要集中于在多酚的提取以及生物活性等方面,有关神秘果种子多糖的提取研究尚未见文献报道。植物多糖是一类具有高活性的物质,如免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖等[6]。因此,受到越来越多研究者的关注[7]。

常用于多糖的提取方法有:溶剂提取法、酸碱提取法、酶解法提取法、超声波提取法、微波提取法等[8]。溶剂提法设备简单、成本低廉,对植物组织的穿透性强,但耗时较长[9]。酸碱提取法虽然提取率有所提高,但酸碱提取法具有特殊性,仅在某些特定的植物多糖提取中有优势。同时,若酸碱度不当,酸性条件可能引起多糖的糖苷键断裂,碱性条件会使部分多糖分解[10]。超声波提取法简单高效,可避免温度过高引起不稳定成分分解。因此,综合各因素,本实验通过超声波辅助以水为提取试剂,采用响应面分析法优化神秘果种子多糖的提取工艺,并对其抗氧化活性进行了评价。为神秘果种子的深入研究和综合开发利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

神秘果种子采自海南省保亭县,经海南师范大学生命科学学院钟琼蕊教授鉴定为山榄科植物神秘果(Synsepalumdulcificum)的种子,标本现存于热带药用植物化学教育部重点实验室,备用;1,1,-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)美国Sigma公司;乙醚、95%乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、VC等均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

XO-5200DTS超声波清洗仪南京先欧仪器制造有限公司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;Nicolet 6700智能傅立叶红外光谱仪美国Thermo Scientific公司;RE-52AA旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;LGJ-10冷冻干燥机北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2实验方法

1.2.1神秘果种子多糖提取工艺流程神秘果种子→粉碎(过60目筛)→乙醚脱脂(索氏提取)→挥干乙醚→除杂(95%乙醇浸泡2 d)→抽滤、干燥→超声波提取2次→抽滤→旋转蒸发浓缩→脱蛋白(Saveg法除蛋白质2次)→透析除去杂质→乙醇沉淀(加入4倍体积95%乙醇,4 ℃静置过夜)→抽滤→脱色(无水乙醇和丙酮反复洗涤)→水复溶→冷冻干燥→神秘果种子粗多糖。

1.2.2标准曲线的绘制采用硫酸-苯酚比色法[11]略加修改。精确称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖100.00 mg,定容于1000 mL容量瓶中。精确移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶,分别加蒸馏水至2 mL,再加入5%苯酚1 mL,迅速加入浓硫酸5 mL,缓慢摇匀。沸水浴20 min后,冷却至室温。测490 nm吸光度。以横坐标为葡萄糖质量浓度(mg/mL),纵坐标为吸光度,绘制标准曲线。

1.2.3神秘果种子多糖的提取及含量的测定精密称取神秘果种子粉末1.0 g,置于100 mL锥形瓶中,以相应液料比加入一定体积蒸馏水,封口膜密封后,振荡10 min,置于超声波中,按一定的超声时间及提取温度进行提取(45 kHz频率固定)2次。趁热抽滤,合并提取液。将提取液旋转蒸发浓缩,Saveg 法除蛋白质2次,透析除去杂质。趁热加4倍体积95%乙醇,4 ℃静置24 h,析出沉淀多糖,抽滤,用无水乙醇和丙酮洗涤。用适量蒸馏水复溶,定容于50 mL容量瓶作为样品液,取适量按标准曲线的绘制方法测样品中多糖的质量浓度。多糖得率按如下式公式计算:

多糖得率(%)=提取多糖的质量/预处理后种子粉末的质量×100

1.2.4单因素实验

1.2.4.1超声波功率对多糖提取率的影响固定超声波温度为40 ℃,超声波时间为30 min,料液比为1∶30(g/mL)，考察不同超声波功率(35、40、45、50、55 kHz)对多糖提取率的影响。

1.2.4.2料液比对多糖提取率的影响在1.2.4.1的基础上，固定超声波温度为40 ℃,超声波时间为30 min,考察不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 m∶V)对多糖提取率的影响。

1.2.4.3超声波时间对多糖提取率的影响固定超声波温度为40 ℃,采用1.2.4.1、1.2.4.2中最佳超声功率、料液比，考察不同超声波时间(20、30、40、50、60 min)对多糖提取率的影响。

1.2.4.4超声波温度对多糖提取率的影响采用1.2.4.1、1.2.4.2和1.2.4.3中最佳超声功率、料液比和超声波时间，考察不同温度(30、40、50、60、70 ℃)对多糖提取率的影响。

1.2.5响应面实验设计在单因素实验的基础上,利用响应面分析法优化神秘果种子多糖的提取工艺。根据Box-Behnken的中心组合设计原理,并综合单因素实验结果,以料液比(A)、超声波时间(B)、超声波温度(C)为3个影响因素,以神秘果种子多糖提取率为响应值。采用统计分析软件Design-Expert 8.0,建立3因素3水平的响应面分析法,进行二次多项回归方程拟合及其优化分析。实验因素与水平设计见表1。

表1　实验因素与水平设计

1.2.6神秘果种子多糖的抗氧化能力

1.2.6.1对DPPH自由基清除能力的测定参照文献[12]修改如下:取不同质量浓度的样品液2 mL,和2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液混合均匀,室温避光放置30 min,测定517 nm处吸光值为A1;同法,测定2 mL乙醇加样品液的吸光值为A2;测定2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水的吸光值为A0。以VC作阳性对照。DPPH清除率计算公式为:

1.2.6.2对ABTS+自由基清除能力的测定参照文献[13]略加修改。首先配制ABTS+溶液,用乙醇调节pH,使734 nm处的吸光值为0.70±0.20备用。取不同质量浓度的样品液100 μL,加入1.9 mL ABTS+,摇匀,室温反应6 min测734 nm处的吸光值为Ax。同法,以乙醇代替ABTS测定吸光值为Ay;以乙醇代替样品测定吸光值为Az。以VC作阳性对照。ABTS+清除率计算公式为:

1.2.6.3对·OH自由基清除能力的测定参考Smiroff等采用的水杨酸法[14],并略作修改。取8mmol/L的FeSO4溶液0.5mL,加入6mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.8mL和0.5mL蒸馏水,摇匀,37 ℃水浴30min。再加入不同质量浓度样品液1.0mL,水浴30min。测520nm处吸光值为Aa;同法,用蒸馏水代替水杨酸,测吸光值为Ab;用蒸馏水代替样品液,测吸光值为Ac。以VC作阳性对照。清除率计算公式为:

新闻传播学、戏剧影视学两个学科都具有中国传媒大学的独到优势和特色。首先体现在“综合”。新闻传播学起步于广电，随着中国整个媒体行业的快速发展，从广电延伸到电子媒体，再从电子媒体延伸到视听新媒体、融媒体。戏剧影视学也大致如此，起步是电视艺术，电视艺术后来延伸到视觉艺术，又延伸到影视行业，最后将戏剧和戏曲也纳入其中。第二个特点就是“交叉”。新闻传播学、戏剧与影视学不仅载体、平台有交叉，艺术、技术也有交叉。特别是这几年大数据、智能媒体的兴起，使它们的覆盖领域更加宽泛。交叉、融合肯定是未来方向，需要开启新闻传播学、戏剧影视学的新视野和新维度，促进学科建设与发展的良性循环。

1.3数据处理

运用Excel和Design-Expert8.0.6软件对实验数据进行分析。

2　结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线

以葡萄糖浓度为横坐标,对应吸光值为纵坐标,绘制标准曲线如图1所示。得到回归方程y=10.564x+0.0628(R2=0.9993),吸光度与葡萄糖浓度具有良好的线性关系,因此,可用于神秘果种子多糖含量的测定。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1　The standard curve of glucose

2.2单因素实验

2.2.1超声波功率对多糖得率的影响超声波功率对多糖得率的影响如图2所示。随着超声波功率提高,多糖提取率增加,这可能由于超声波空化作用加快种子细胞壁和细胞膜的破碎使多糖更容易被提取。在超声波功率为45 kHz时,多糖提取率达到最大值,之后超声波功率再提高,多糖提取率略有降低。说明当超声功率达到一定程度,导致部分多糖结构被破坏。因此,选最佳超声波功率为45 kHz。

图2　超声波功率对多糖得率的影响Fig.2　Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

图3　料液比对多糖得率的影响Fig.3　Effect of radio of material to iquid ratio on the yield of polysaccharide

2.2.3超声波时间对多糖得率的影响超声波时间对多糖得率的影响如图4所示,随着时间的延长,多糖的提取率呈先增大后减小的趋势。因为超声波可在短时间内使细胞破裂,加速多糖溶出。当提取时间超过40 min,多糖溶液趋于饱和,大量的多糖吸附在颗粒表面,阻碍多糖继续溶出。同时超声时间过长可能使多糖结构被破坏,杂质的溶出也会相对增多,从而减缓了多糖的溶出速率,最终导致多糖总量下降。因此,选最佳超声波时间为40 min。

图4　超声波时间对多糖得率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

2.2.4提取温度对多糖得率的影响提取温度对多糖得率的影响如图5所示,在温度30～40 ℃之间,多糖得率逐渐增大。当提取温度为50 ℃时,多糖得率最高为12.32%。因为温度过低多糖不能充分溶出,升高温度可加速分子间运动,促使逐渐溶出。当温度大于50 ℃时,随着温度升高多糖得率反而降低,因为较高的温度可能会破坏多糖的结构[16],杂质的溶出也会增加,导致多糖含量降低。因此,选最佳提取温度为50 ℃。

图5　提取温度对多糖得率的影响Fig.5　Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide

2.3响应曲面法优化实验结果与分析

2.3.1回归模型的建立与分析对4个单因素变量进行显著性分析,料液比、超声时间、提取温度影响显著，因此选取3个因素设计3因素3水平的响应面分析实验，其中超声功率固定为45 kHz。

通过Design Expert软件,对表2数据进行线性拟合得到以上二次多项回归模型方程:

Y=12.33+0.24A-0.046B-0.024C+0.072AB-0.013AC+0.11BC-0.43A2-1.26B2-0.30C2

表2　Box-Behnken实验设计和结果分析

2.3.2响应曲面模型的分析通过响应曲面模型可以确定最佳工艺参数及各因素间相互作用,响应面模型和等高线图见图6～图8。从图6可以看出,料液比(A)和超声时间(B)的等高线为椭圆形,说明其交互作用显著;料液比轴向的等高线变化密集,说明料液比比提取温度对多糖得率的影响大。从图7可以看出,料液比(A)和提取温度(C)的等高线趋于圆形,说明其交互作用不显著。从图8可以看出,超声时间(B)和提取温度(C)的等高线为椭圆形,表明其交互作用显著;提取时间轴向的等高线密集,说明提取温度比提取时间对多糖得率的影响大。选择适当的料液比(A)、超声时间(B)和提取温度(C),可以达到较高的多糖得率。三个因素对多糖得率的影响从大到小依次为:料液比(A)>超声时间(B)>提取温度(C)。

表3　二次响应面回归模型方差分析

图6　料液比和超声时间对多糖得率的响应曲面图Fig.6　Response surface of material to liquid ratio and ultrasonic time on the yield of polysaccharide

图7　料液比和提取温度对多糖得率的响应曲面图Fig.7　Response surface of material to liquid ratio and extraction temperature on the yield of polysaccharide

图8　超声时间和提取温度对多糖得率的响应曲面图Fig.8 Response surface of ultrasonic time and extraction temperature on the yield of polysaccharide

注:**表示极显著(p<0.01);*表示显著(0.01

优化后的神秘果种子多糖最佳提取工艺条件为:料液比1∶42.79(g/mL)、提取温度49.87 ℃、超声时间 39.53 min,在此条件下,神秘果种子多糖得率可达12.36%。为方便实际操作,将优化参数修正为:料液比1∶43(g/mL)、提取温度50 ℃、超声时间40 min,平行3次实验多糖平均得率为12.33%,与预测值12.36%接近,说明此优化模型可靠。

2.5神秘果种子多糖抗氧化能力

2.5.1对DPPH自由基的清除作用不同质量浓度的神秘果种子多糖和VC对清除DPPH自由基的影响,如图9所示。在质量浓度0～0.5 mg/mL范围内,多糖和VC对DPPH自由基清除率均随着质量浓度增大而升高。当多糖浓度达到0.4 mg/mL时,继续增大浓度,清除率随浓度变化不明显,此时的清除率为57.13%,相比VC对DPPH自由基的清除率低38%,可见神秘果种子多糖对DPPH自由基的清除能力明显低于VC。经计算神秘果种子多糖对清除DPPH自由基的IC50为0.31 mg/mL。

图9　神秘果种子多糖和VC对DPPH·的清除作用Fig.9　Scavenging effect of polysaccharides from S. dulcificum and VC on DPPH·

2.5.2对ABTS+自由基的清除作用不同质量浓度的神秘果种子多糖和VC对清除ABTS+自由基的影响,如图10所示。在质量浓度0～0.5 mg/mL范围内,多糖和VC对ABTS+自由基清除率均随着质量浓度增大而明显升高。当多糖质量浓度为0.5 mg/mL时,对ABTS+自由基的清除率达到62.21%。说明神秘果种子多糖对ABTS+自由基的清除率与浓度呈较强的剂量正相关效应,但清除率低于VC。经计算神秘果种子多糖对ABTS+自由基的IC50为0.41 mg/mL。

图10　神秘果种子多糖和VC对ABTS+的清除作用Fig.10　Scavenging effect of polysaccharides from S. dulcificum and VCon ABTS+

2.5.3对·OH的清除作用不同质量浓度的神秘果种子多糖和VC对清除·OH的影响,如图11所示。在质量浓度0～0.2 mg/mL范围内,清除率随多糖浓度增大整体呈上升趋势。当浓度达到0.2 mg/mL时,清除率迅速升高,直至浓度达到0.4 mg/mL时,清除率升高程度减缓。当质量浓度达到0.5 mg/mL时,清除率达到85.32%,此时较同浓度的VC对·OH的清除率低8.13%。说明神秘果种子多糖对·OH的清除率与浓度呈正相关,当质量浓度达到0.5 mg/mL时与VC相差不大。经计算神秘果种子多糖对·OH自由基的IC50为0.24 mg/mL。

图11　神秘果种子多糖和VC对·OH的清除作用Fig.11　Scavenging effect of polysaccharides from S. dulcificum and VC on ·OH

图12　神秘果种子多糖和VC对·的清除作用Fig.12　Scavenging effect of polysaccharides from S.

3　结论

将响应面分析法应用于超声波提取神秘果种子多糖工艺的研究。在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken实验设计对超声波提取神秘果种子多糖优化的工艺参数为:料液比1∶43(g/mL)、提取温度50 ℃、超声时间40 min,实测得率12.33%与预测得率12.36%接近,说明该模型可用于对神秘果种子多糖的预测,具有一定的理论价值与实际应用前景。

[1]卢圣楼,刘红,曹佳佳,等. 神秘果中齐墩果酸和五环三萜含量的测定[J]. 食品工业,2012,33(3):130-133.

[2]卢圣楼. 神秘果叶营养价值和挥发油化学成分分析及其总黄酮提取纯化与药理化学评价[D]. 海口:海南师范大学,2013.

[3]卢圣楼,刘红,贾桂云,等. 神秘果叶营养成分分析与评价[J]. 食品研究与开发,2014,35(17):111-114.

[4]齐赛男,贾桂云,卢圣楼,等. 神秘果种子挥发油化学成分的气相色谱-质谱分析[J]. 海南师范大学学报:自然科学版,2012,25(1):73-76.

[5]马艺丹,刘红,廖小伟,等. 神秘果种子多酚超声双水相复合提取工艺及其抗氧化活性[J]. 食品与机械,2015,31(6):173-178.

[6]叶展,胡传荣,胡晚华,等. 响应面法优化茶叶籽粕中多糖的提取工艺[J]. 食品工业科技,2015,36(6):230-234.

[7]陈莉华,高文昱,王晓静,等. 竹笋总多糖的提取及抗氧化活性研究[J]. 林产化学与工业,2014,34(5):157-161.

[8]庒永亮,孙丽平,尚小丽,等. 红托竹荪菌盖多糖的提取与抗氧化能力的研究[J]. 林产化学与工业,2011,31(3):45-49.

[9]李颖畅,王亚丽,齐凤元,等. 响应面法优化蓝莓叶多糖提取工艺[J]. 食品工业科技,2015,36(3):227-231.

[10]李奎,李雪玲. 响应面法优化碱液提取百草蕊草多糖的工艺研究[J]. 食品工业科技,2015,36(7):204-207.

[11]刘云,唐军荣,辛培尧,等. 响应面分析法优化组培金线莲多糖提取工艺研究[J]. 食品工业科技,2015,36(14):244-248.

[12]SABIR S M,AHMAD S D,HAMID A,et al. Antioxidant and hepatoprotective activity of enthanolic extract of leaves of Solidago microglossa containing polyphenolic compounds[J]. Food Chemistry,2012,131(3):741-747.

[13]ZHU K X,LIAN C X,GUO X N,et al. Antioxidant activities and total phenolic contents of various extracts from defatted wheat germ[J]. Food Chemistry,2011,126(3):1122-1126.

[14]SMIROFF N,CUMBES Q J. Hyroxylradical scaven-ging activity compatiblesolutes[J]. Phytochemistry,1989,28(4):1057-1060.

[15]WANG Z J,LIAO D K. Study on the anti-oxidant activity of polysaccharide in Agrocybe aegerita[J]. 食品研究与开发,2010,31(4):50-55.

[16]朱丽蓉,吴萍萍,杨大伟,等. 杜仲雄花茶多糖的响应面优化提取及其抗氧化活性评价[J]. 食品工业科技,2015,36(3):199-203.

Study on the optimization of extracting polysaccharides fromSynsepalumdulcificumseed by response surface methodology and evaluation of antioxidant activity

MA Yi-dan1,LIU Hong1,2,*,MA Si-cong1,YAN Rui-xin1,XUE Bing-xiang1,WANG Qian1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou 571127,China;2.Key Laboratory of Research and Development on Topical and Special Medicine and Edible Plant,Haikou 571127,China)