赵　岩,彭　蕾,郜玉钢,何忠梅,杨　鹤,刘双利,张连学

(吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118)



甘草不同溶剂提取物对AChE、ACE以及α-葡萄糖苷酶的抑制活性和对亚硝酸根清除活性的研究

赵岩,彭蕾,郜玉钢*,何忠梅,杨鹤,刘双利,张连学*

(吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130118)

目的:研究甘草不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)、血管紧张素转化酶(ACE)活性的影响以及对亚硝酸根离子的清除能力。方法:采用高效液相色谱法测定甘草不同溶剂提取物对ACE的抑制作用,采用分光光度法测定其对α-葡萄糖苷酶、AChE的抑制作用及对亚硝酸根离子的清除能力。结果表明:甘草石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物均对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制作用,其IC50值分别为3.212、0.151、0.891 mg/mL,优于阳性药阿卡波糖;甘草提取物乙酸乙酯部位、水部位对AChE有较强的抑制作用,其IC50值为0.489、0.872 mg/mL,优于阳性药利斯的明;甘草乙酸乙酯提取物对亚硝酸根离子有较强的清除能力,其IC50值为1.068 mg/mL,优于阳性药VC;甘草乙酸乙酯提取物对ACE有较强的抑制作用,其IC50值为0.815 mg/mL,优于其阳性药卡托普利。在这5种甘草不同溶剂提取物中,甘草乙酸乙酯提取物抑制活性最强。结论:甘草乙酸乙酯提取物具有很强的α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE抑制作用且对亚硝酸离子有很好的清除能力。

甘草,抑制ACE的活性,抑制AChE的活性,抑制α-葡萄糖苷酶的活性,亚硝酸根离子清除活性

常用中药甘草为豆科植物,中国药典一部2010年版收载为甘草(GlycyrrhizauraleusisFisch.)、胀果甘草(G.inflataBat.)或光果甘草(G.glabraL.)的根及根茎[1],其中甘草为主流品种[2]。甘草的化学成分主要为黄酮、三萜、香豆素等[3-7],甘草的主要药理活性为保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、镇咳、抗疟、抗氧化、免疫调解和抗血小板凝集等[8-11]。虽然对甘草的药理活性的研究已经很深入,但目前对于研究甘草不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性以及对亚硝酸根离子清除活性的研究并不深入。并且目前临床上应用的α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE等抑制剂主要为西药如卡托普利、利斯的明、阿卡波糖等,价格都比较昂贵而且具有副作用。而甘草本身就是药食同源,因此本研究选取甘草为实验对象,分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇、蒸馏水为溶剂提取其成分,测定其对α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE的抑制活性以及对亚硝酸根离子的清除活性,并比较不同溶剂提取物活性的差别。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

甘草购买于吉林大药房,经吉林农业大学杨利民教授鉴定为甘草(GlycyrrhizauralenisisFisch)的干燥根;乙酰胆碱酶、血管紧张素转化酶、α-葡萄糖糖苷酶、马尿酰-组氨酸-亮氨酸、马尿酸(BR>98%)美国Sigma公司;蔗糖、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、碘化硫代乙酰胆碱(AChI)、对氨基苯磺酸、N-1一萘基乙二胺盐酸盐阿拉丁公司;卡托普利片国药准字H31022986,中美上海施贵宝制药有限公司;阿卡波糖片国药准字H19990205,拜耳医药有限公司;利斯的明国药准字H20130081,Novartis Farmaceutica S A;维生素C片国药准字H32025345,无锡济民可信山禾药业股份有限公司;其余试剂均为分析纯。

CXTH-3000型高效液相色谱仪北京创新通恒科技有限公司;WD-2102A型自动酶标仪北京市八一仪器厂;HH-4型数显恒温水浴锅箱江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;KQ-500DV型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1甘草不同溶剂提取物的制备取粉碎好的甘草药材100 g置于1000 mL锥形瓶中,依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、95%乙醇、蒸馏水为溶剂按1∶10、1∶8、1∶6的比例,60 ℃超声2 h,并将同溶剂的提取液进行合并,用旋转蒸发仪进行浓缩,然后冷冻干燥得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、蒸馏水提取物。

1.2.2α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的测定供试品溶液的制备:取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)缓冲液中,即为初始浓度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)缓冲液依次稀释为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供试品溶液。

根据文献方法改进[12-14],检测在96孔酶标板中进行,加入样品溶液10 μL,15 μLα-葡萄糖糖苷酶,加入25 mmol/L蔗糖溶液和PBS(pH=6.8)缓冲液各10 μL,37 ℃反应15 min,最后加入葡萄糖测试盒工作液180 μL,37 ℃温育反应15 min后,使用全自动酶标仪在波长490 nm下读取OD值,并记录。每个体系同时做3个平行,取平均值。实验以PBS(pH=6.8)缓冲液代替样品溶液作为阴性,以阿卡波糖(拜糖平)代替样品溶液作为阳性。以PBS(pH=6.8)缓冲液代替α-葡萄糖糖苷酶作为样品对照。按照抑制率(%)=OD阴性-(OD样品-OD样品对照)/OD阴性-OD空白×100计算,并求出相应的IC50值。

1.2.3乙酰胆碱酶抑制活性的测定供试品溶液的制备:取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)缓冲液中,即为初始浓度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)缓冲液依次稀释为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供试品溶液。

根据已有的方法进行改进[15-16],检测在96孔酶标板中进行,加入140 μL PBS缓冲液(pH=8.0),加入20 μL样品,再加入15 μL AChE 溶液在微孔里混合,振荡混匀,4 ℃培养20 min。然后加10 μL 0.01 mol/L的DTNB,最后加10 μL 0.075 mol/L的AChI开始反应。37 ℃培养20 min后,405 nm下测OD值。实验以20 μL PBS溶液代替样品溶液作为空白组,以20 μL PBS溶液代替样品溶液和15 μL PBS溶液代替酶液作为空白对照组,并以15 μL PBS溶液代替酶液作为样品对照组并以利斯的明溶液作为阳性对照。按照抑制率(%)=[(OD空白-OD空白对照)-(OD样品-OD样品对照)]/(OD空白-OD空白对照)×100计算抑制率,并求出相应的IC50值。

1.2.4清除亚硝酸根离子能力的活性筛选

1.2.4.1供试品溶液的制备取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)缓冲液中,即为初始浓度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)缓冲液依次稀释为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供试品溶液。

加入样品溶液10 μL,20 μL 0.5 mg/mL亚硝酸钠溶液,40 μL蒸馏水,最后再加入140 μL柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH=3)溶液,37 ℃ 水浴1 h,取出冷却至室温。实验以10 μL蒸馏水代替样品溶液作为空白,以20 μL蒸馏水代替亚硝酸钠溶液作为样品对照,以200 μL柠檬酸钠-盐酸缓冲液作为空白对照。以VC作为阳性对照。备用。

1.2.4.2亚硝酸根离子清除能力的测定在96孔酶标板中,准确吸取20 μL上述供试品溶液,40 μL 0.4%对氨基苯磺酸溶液摇匀,5 min后加入20 μL 0.2% N-1乙二胺盐酸盐溶液和120 μL蒸馏水。摇匀静置15 min后于492 nm处测定OD值。按照清除率(%)=[(OD空白-OD空白对照)-(OD样品-OD样品对照)]/(OD空白-OD空白对照)×100,并求出相应的IC50值。

表1　甘草提取物对α-葡萄糖糖苷酶的抑制活性(n=3)

注:“-”未检测出;与阳性组比较:*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01);表2～表4同。

表2　甘草提取物对乙酰胆碱酶的抑制活性(n=3)

1.2.5ACE抑制活性的测定供试品溶液的制备:取提取物4 mg定容于200 μL的PBS(pH=6.8)缓冲液中,即为初始浓度20 mg/mL,然后用PBS(pH=6.8)缓冲液依次稀释为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的供试品溶液。

色谱条件:色谱柱ODS-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:甲醇∶三氟乙酸水溶液(0.01%)=40∶60,检测波长:228 nm,流速:0.5 mL/min,柱温:25 ℃,进样量:20 μL。

加入75 μL硼酸钾缓冲液(pH=8.3),加入样品溶液10 μL,加入5 mmol/L底物马尿酰-组氨酸-亮氨酸10 μL,37 ℃保温5 min后,再加入5 μL ACE酶溶液,混匀,37 ℃培养30 min,最后加入1 mol/L HCl溶液300 μL终止反应,10000 r/min离心10 min,吸取上清,备用。实验以10 μL硼酸钾缓冲液(pH=8.3)代替样品溶液作为空白组,以卡托普利为阳性对照。在上述色谱条件下取供试品溶液进行测定,记录色谱峰面积并计算含量。按照抑制率(%)=(Ab-Ati)/Ab×100(Ab和Ati分别为空白对照组和实验组马尿酸的峰面积)计算提取物的抑制率,并求出相应的IC50值。

1.3数据处理

采用SPSS 19. 0统计软件包进行统计学处理,实验结果数据用均数士标准差表示。

2　结果与分析

2.1甘草不同溶剂提取物对α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的测定结果

测定甘草不同溶剂提取物对α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的影响,结果见表1。从表1中可看出,随着浓度的增大,抑制率也逐渐增大,说明提取物的浓度与抑制率成正比。与相同浓度阳性对照组比较,氯仿提取物抑制率极显著低于阳性对照组;在浓度为0.625～10 mg/mL时,95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物抑制率极显著(p<0.01)高于阳性对照组,在浓度为5～20 mg/mL时,水提物的差异显著低于阳性对照组,石油醚提取物(除5 mg/mL)无显著差异。从抑制率和IC50值分析,与阳性相比氯仿提取物和水提物对α-葡萄糖糖苷酶的抑制作用弱于阳性药阿卡波糖,而乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、石油醚提取物对α-葡萄糖糖苷酶的抑制作用强于阳性药。说明这三种提取物中聚集了抑制α-葡萄糖糖苷酶的化学成分,孙佳明等[17]研究也表明甘草95%乙醇提取物中含有抑制α-葡萄糖糖苷酶的化学成分。

2.2甘草不同溶剂提取物对乙酰胆碱酶的抑制活性

测定甘草不同溶剂提取物对乙酰胆碱酶抑制活性的影响,结果见表2。表2数据表明随着浓度的增大,抑制率也逐渐增大,说明抑制率对浓度有一定的依赖性。从显著性差异来分析,与阳性对照组比较,在浓度为0.625～20 mg/mL时氯仿提取物、石油醚提取物、95%乙醇提取物抑制活性极显著低于阳性药;在浓度为1.25～5 mg/mL时水提取物抑制活性显著低于阳性药,10～20 mg/mL水提物抑制活性极显著低于阳性药;乙酸乙酯提取物无显著差异。从抑制率和IC50值分析,与阳性相比,氯仿提取物、石油醚提取物、95%乙醇提取物和水提物的抑制作用低于阳性药利斯的明,然乙酸乙酯提取物的抑制作用强于阳性药。综上所述乙酸乙酯提取物具有很强的乙酰胆碱酶抑制活性。

2.3甘草不同溶剂提取物对亚硝酸根离子的清除能力

表3　甘草提取物对亚硝酸根的清除活性(n=3)

表4　甘草提取物对ACE的抑制活性(n=3)

测定甘草不同溶剂提取物对亚硝酸根离子的清除能力,结果见表3。表3数据表明随着浓度的增大,清除率也随之增大,说明清除率对浓度有一定的依赖性。与阳性对照组比较,在浓度为1.25～20 mg/mL时氯仿提取物、石油醚提取物清除率极显著低于阳性对照药;在浓度为0.625～2.5 mg/mL水提物显著低于阳性对照药;乙酸乙酯提取物无显著差异。从清除率和IC50值分析,与阳性相比,氯仿提取物、石油醚提取物、乙醇提取物和水提物的清除能力低于阳性药VC,然而乙酸乙酯提取物的清除能力高于阳性药。综上所述乙酸乙酯提取物具有很强的亚硝酸根清除能力。

2.4甘草不同溶剂提取物对ACE抑制活性的测定结果

测定甘草不同部溶剂位提取物对ACE抑制活性的影响,结果见表4。表4数据表明随着浓度的增大,抑制率也随之增大,说明抑制率对浓度有一定的依赖性。与阳性对照组比较,在浓度为1.25～20 mg/mL石油醚提取物ACE抑制率极显著低于阳性药;在10～20 mg/mL时95%乙醇提取物ACE抑制率极显著低于阳性药;乙酸乙酯提取物抑制活性与阳性对照无显著差异。然从抑制率结果和IC50值结果分析,与阳性相比,氯仿提取物、石油醚提取物、95%乙醇提取物和抑制作用低于阳性药卡托普利,而乙酸乙酯提取物的抑制作用高于阳性药。综上所述乙酸乙酯提取物很强的ACE抑制作用。

3　结论与讨论

对甘草不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE抑制活性以及对亚硝酸根离子清除能力进行了筛选研究,测定其IC50值并对其与阳性药进行了显著差异分析。结果表明甘草乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物的降血糖活性最显著且优于阳性药阿卡波糖(IC50=3.392 mg/mL),其IC50值为0.151、0.891 mg/mL;甘草乙酸乙酯提取物对乙酰胆碱酶的抑制作用效果显著优于阳性药利斯的明(IC50=0.703 mg/mL),其IC50值为0.489 mg/mL;甘草乙酸乙酯部位提取物对亚硝酸根得清除活性与其阳性药VC(IC50=1.128 mg/mL)作用效果无明显差异,其IC50值为1.068 mg/mL;甘草乙酸乙酯提取物对ACE的抑制作用效果显著优于阳性药卡托普利(IC50=1.493 mg/mL),其IC50值为0.815 mg/mL。由此可知甘草粗提物乙酸乙酯部位具有较强的α-葡萄糖苷酶、AChE、ACE的抑制作用以及对亚硝酸离子有很好的清除能力,可作为进一步活性追踪的部位。甘草乙酸乙酯提取物的药理作用和具体机制有待进一步研究,为进一步探索甘草提取物化学成分有效活性的研究提供了理论依据。

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Study on AChE,ACE,α-glycosidase inhibitory activity and nitrite scavenging activity of the licorice extracts

ZHAO Yan,PENG Lei,GAO Yu-gang*,HE Zhong-mei,YANG He,LIU Shuang-li,ZHANG Lian-xue*

(Chinese Medicine Material College of Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

Objective:To research the effect of different layer of licorice extracts onα-glycosidase enzymes,AchE and ACE activities and the influence of the effect of nitrite scavenging activity. Methods:Five kinds of licorice extracts were extracted fromGlycyrrhizauraleusisFisch.Their ACE inhibitory activity was determined by HPLC. The extracts’ nitrite scavenging capability and theirα-glucosidase and AChE inhibitory activity were measured by spectrophotometry,respectively. Results:The evaluation results showed that petroleum ether,ethyl acetate and ethanol fractions of licorice possessedα-glucosidase inhibitory effect and their IC50value was 3.212,0.151,0.891 mg/mL,which were more potent than that of acarbose,ethyl acetate,water fractions of licorice possessed AChE inhibitory effect and their IC50value was 0.489,0.872 mg/mL,which were more potent than that of rivastigmine.Ethyl acetate fractions of licorice possessed nitrite scavenging activity and their IC50value was 1.068 mg/mL,which was more potent than that of VC.Ethyl acetate fractions of licorice possessed ACE inhibitory effect and their IC50value was 0.815 mg/mL,which was more potent than that of captopril,so ethyl acetate fractions of licorice was the most potent inhibitory in five kinds of licorice extracts. Conclusion:Ethyl acetate fractions ofGlycyrrhizauraleusisFisch have shown high ACE,AChE andα-glycosidase inhibitory capacity and nitrite scavenging activity so they will be further guided isolation and purified to obtain active compounds.

GlycyrrhizauraleusisFisch;ACE inhibitory activity;AChE inhibitory activity;α-glycosidase inhibitory activity;nitrite scavenging activity

2015-10-22

赵岩(1979-)，男，博士，副教授，主要从事天然药物化学成分与生物活性方面的研究，E-mail：zhyjlu79@163.com。

郜玉钢(1970-),博士,教授,研究方向：药用植物栽培与加工，E-mail:gaoyugang_2006@163.com。

张连学(1955-), 博士,教授,研究方向：药用植物栽培与加工，E-mail:zlx863@163.com。

国家公益性行业科研专项(201303111)；吉林省科技发展计划项(20140204013YY, 20150307012YY)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)10-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.029