芒果果肉抗氧化成分测定及其对自由基清除能力的研究

2016-09-10李晓博胡文忠姜爱丽刘程惠

食品工业科技 2016年10期

关键词：抗氧化物吸光类黄酮

李晓博,胡文忠,姜爱丽,刘程惠

(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

芒果果肉抗氧化成分测定及其对自由基清除能力的研究

李晓博,胡文忠*,姜爱丽,刘程惠

(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连 116600)

芒果,抗氧化剂,含量,自由基,抗氧化能力

芒果(MangiferaindicaLinn)是漆树科杧果属植株的果实,其色、香、味俱全且营养丰富,素有“热带果王”的美誉。目前已成为继葡萄、香蕉、柑橙、苹果后的世界第五大水果。芒果营养价值很高,其果肉中含有丰富的抗氧化剂,如多酚类、黄酮类、维生素C类、胡萝卜素及还原型谷胱甘肽(GSH)等[1-3]。Soong[4]等通过研究得知芒果中的芒果黄酮是一种具有较强的抗氧化活性的抗氧化剂,同时也有研究表明芒果中其他各类型的抗氧化物质含量均很高,如类黄酮及维生素C等[5]。

广西、广东、海南、云南及台湾等地区均是我国芒果种植较广的区域,芒果果肉除鲜食外,主要用于制作各种加工产品,如果汁、蜜饯、果酱等,利用率低[6-7]。因此,探究芒果果肉的抗氧化能力对于我国芒果的利用率和居民身体素质及生活质量均有十分重要的意义。本实验以海南金龙芒果为研究对象,测定其果肉中各类抗氧化物质含量,并在此基础上对比了芒果果肉提取物与几种天然抗氧化剂对自由基的清除能力,为芒果果肉的深加工产品及利用前景提供参考。

1　实验部分

1.1材料与仪器

T-25型匀浆机德国IKA公司;BR4i型台式高速冷冻离心机法国Jouan公司;PL203精密电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DK-S26型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司;SIM-F140型制冰机日本三洋;真空抽滤机SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵。

表1　还原型谷胱甘肽标准曲线的制作所用试剂

1.2实验方法

1.2.1芒果果肉中抗氧化物含量的测定

1.2.1.1总酚采用顾海峰[8]及罗娅等人的方法[9]并稍作修改。

标准曲线的绘制:精确称取0.0170 g没食子酸,用1%盐酸-甲醇溶液溶解,定容至100 mL,配制成1 mmol/L的母液。经1%盐酸-甲醇溶液分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L,于280 nm处测吸光值,以盐酸-甲醇溶液作空白参比调零。

称取2.0 g果肉组织,加入少许经预冷的1% HCl-甲醇溶液,冰浴条件研磨匀浆,转入20 mL刻度试管中,研钵经1% HCl-甲醇溶液冲洗后一并转移至试管中,定容至刻度,混匀,于4 ℃避光提取20 min,过滤,收集滤液,测定波长280 nm处吸光值。得线性回归方程y=8.65x+0.0205,R2=0.9955。

利用盐酸甲醇溶液从芒果组织中提取总酚物质,根据总酚物质的甲醇提取液的吸收光谱特性,利用紫外可见分光光度计在特定波长下测定吸光值,进而与标准曲线比较,计算含量,此方法简单易行,重复性好。

1.2.1.2类黄酮芦丁标准曲线绘制及类黄酮含量测定方法同1.2.1.1,于325 nm处测定吸光值。得线性回归方程y=3.7786x+0.0192,R2=0.9816。

1.2.1.3维生素C采用2,6-二氯酚靛酚法测定芒果果肉中VC的含量[10],称取10.0 g芒果样品,加入少量20 g/L草酸溶液,冰浴条件研磨成浆,用20 g/L草酸溶液清洗定容至1000 mL,静置10 min,收集滤液。准确吸取10.0 mL滤液,用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴至微红色、静置15 s不褪色后即为滴定终点,以10 mL 20 g/L草酸溶液作为空白。每100 g芒果果肉中维生素C含量计算公式如下:

式中:V是样品提取液总体积,mL;V1为样品滴定消耗染料体积,mL;V0是空白滴定消耗染料体积;ρ是1 mL染料溶液相当于抗坏血酸的质量,mg/mL;Vs是滴定时所取样品溶液体积,mL;m为样品质量,g。

1.2.1.4GSH测定方法采用文献[11-12]的方法稍加改动。

标准曲线的绘制:取6支试管,编号,按照表1加入各种试剂,混匀,于25 ℃保温反应10 min,以0号管为参比调零,测定显色液在波长412 nm处的吸光值。以吸光值为纵坐标,还原型谷胱甘肽的质量浓度(mg/mL)为横纵标,绘制标准曲线,得线性回归方程为y=0.0064x-0.0192,R2=0.9982。

称取5.0 g芒果样品置于研钵中,加入5.0 mL经4 ℃预冷的50 g/L三氯乙酸溶液(含5 mmol/LEDTA-Na2),冰浴匀浆,于4 ℃、12000 r/min离心20 min,收集上清。取1支试管,依次加入1.0 mL去离子水、1.0 mL 0.1 mol/L、pH7.7磷酸缓冲液及1.5 mL 0.15 mol/L NaOH溶液并摇匀,加入0.5 mL φ=0.03甲醛,摇匀后静置2 min,加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液,混匀,以此溶液作为参比在波长412 nm处对分光光度计进行调零。此方法因甲醛在碱性溶液中可以有效掩蔽半胱氨酸等含巯基化合物,可有效避免其干扰测定结果。

另取2支试管,分别加入1.0 mL上清液、1.0 mL 0.1 mol/L、pH7.7磷酸缓冲液。一支试管中加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液,另一支试管中加入0.5 mL 0.1 mol/L、pH6.8磷酸缓冲液,置于25 ℃保温反应10 min。迅速测定显色液在波长412 nm处的吸光值,分别记作ODS和ODC,从标准曲线上得出相应的GSH质量浓度。每100 g芒果果肉中GSH含量的计算公式:

式中:ρ为由标准曲线查得的溶液中还原型GSH物质的量,mg/mL;V为样品提取液总体积,mL;m为样品质量,g。

1.2.2芒果果肉与天然抗氧化剂抗氧化能力的比较研究

1.2.2.1样品溶液制备称取2 g芒果样品,用HCl-甲醇溶液(含体积比为1%的盐酸和50%的甲醇)匀浆,定容到40 mL,避光放置2 h后离心,期间晃动震动数次,上清液用甲醇稀释10倍作为样品溶液。

根据1.2.1中测定的实验结果,配制浓度为50、30、80及12 mg/100 g的没食子酸、芦丁、VC及GSH待用。

1.2.2.2对·OH清除作用的测定根据文献[13],利用Fenton反应检测抗氧化物对羟基自由基的清除作用。按顺序分别取l.5 mL pH7.4、0.15 mol/L的磷酸缓冲液、0.2 mL 260μg/mL的番红溶液,0.7 mL 2 mmol/L的EDTANa2-Fe2+,1 mL样品溶液,0.8 mL H2O2混匀后于37 ℃水浴保温30 min,在波长510 nm处测吸光度A。空白组以等体积的去离子水代替样品溶液;对照组以等体积的3%H2O2代替样品溶液和EDTANa2-Fe2+溶液,每组三个平行,按下公式计算。

式中:A样品为样品组吸光度值;A对照为对照组吸光度值;A空白为空白组吸光度值。

1.2.2.3对O-2·清除作用的测定根据文献[14]利用邻苯三酚自氧化体系测定总抗氧化物对超氧阴离子自由基清除作用。取4.5 mL 0.05 mol/L,pH8.25的Tris-HCl缓冲液,加入1 mL样品液,于25 ℃保温25 min。加入0.4 mL 25 ℃预温的3 mmol/L的邻苯三酚。空白组以等量Tris-HCl代替样品液,混匀反应4 min后加0.5 mL的浓盐酸,迅速测定325 nm处吸光值,每组三个平行。

式中:A样品为样品的吸光度;A空白为空白组的吸光度。

1.2.2.4对DPPH·清除作用的测定根据文献[15-16]的方法稍加改动,准确量取DPPH纯溶液49 μL,溶解于甲醇,定容于250 mL棕色容量瓶。0.5 mL 5×10-4mol/L DPPH溶液中加入1 mL 样品溶液及1 mL甲醇溶液,混匀后避光反应30 min,测定517 nm处吸光值。空白组用1 mL甲醇代替样品溶液,每组三个平行。按下式计算样品对DPPH·的清除率。

式中:A样品为样品的吸光度;A空白为空白组时的吸光度。

1.3数据处理

每个样品设3个平行,每次测定重复三次。测定结果以平均数±标准误(x±SD)表示,显著性检验为t检验,显著性水平为p<0.05,方差分析采用SPSS 9.0版本的统计软件进行统计学分析处理。

2　结果与分析

2.1芒果果肉中抗氧化物的含量

根据上述标准曲线及回归方程,对芒果果肉中各类抗氧化物含量测定结果如图1所示:芒果果肉中总酚含量为50 mg/100 g,类黄酮为30 mg/100 g,VC为80 mg/100 g,含量最少的为GSH是12 mg/100 g。由图1可知,芒果果肉中VC含量显著高于总酚、类黄酮及GSH(p<0.05),由高到低依次是:VC>总酚类>类黄酮>GSH。

图1　芒果果肉中各抗氧化成分含量Fig.1　The antioxidant substances content in the pulp of Mango

2.2芒果果肉与抗氧化剂抗氧化能力的比较研究

浓度为50、30、80及12 mg/100 g的没食子酸、芦丁、VC及GSH与芒果果肉对三种自由基的清除能力由图2所示,可知芒果果肉对·OH的清除率为98.36%,显著高于没食子酸、芦丁、VC和GSH这四种抗氧化剂(p<0.05),由于物质结构及有效抗氧化浓度等原因,其他四种抗氧化剂对·OH的清除能力也各不相同,除维生素C外,其他三种抗氧化物对·OH的清除率均在90%以上。且清除能力大小依次为芒果果肉提取物>没食子酸>芦丁>GSH>VC。可能原因为芒果提取物中不仅含有对·OH清除能力显著的总酚、类黄酮、VC及GSH这四类物质,同时也含有VE、类胡萝卜素、多糖等其他种类的抗氧化物,所以其对·OH自由基的清除能力明显强于相当于其体内浓度的其它四种抗氧化物。

图2　芒果果肉与抗氧化剂对自由基的清除能力Fig.2　The scavenging capacity of mango extraction and antioxidant on the free radical

芒果果肉对DPPH·的清除能力12.50%,低于VC,而明显高于没食子酸、芦丁及GSH(p<0.05),清除能力由大到小依次为:VC>芒果提取物>没食子酸>芦丁>GSH。其中,VC对DPPH·自由基清除能力较芒果果肉高的原因可能是VC具有破坏DPPH·本身结构稳定性的功能,并且提供电子与DPPH·内部的孤对电子配对,使DPPH·得到有效的清除[17]。由图也可看出芒果果肉及其他各类抗氧化剂对DPPH·的清除效果不理想,可能原因是DPPH·本身结构稳定,3个苯环形成了空间障碍,使得其中心氮原子上不成对的自由基很难进行电子配对,所以芒果果肉提取物对其清除能力最弱[18],其余抗氧化物不能与DPPH·内部的孤对电子配对,使其不易被抗氧化物破坏,故而不能对其进行有效地清除。

3　结论

经测定,芒果果肉中对自由基具有清除能力的有效抗氧化物质主要有总酚、类黄酮、VC及GSH等,且在本文中,经过测定,实验所用海南金龙芒果果肉中含量最高的抗氧化物质为VC,为80 mg/100 g;其次为总酚,含量为60 mg/100 g;另外,类黄酮含量为30 mg/100 g;含量最少的为GSH,是12 mg/100 g。

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Study on the antioxidant components and antioxidant capacity of theMangiferaindicaLinn pulp

LI Xiao-bo,HU Wen-zhong*,JIANG Ai-li,LIU Cheng-hui

(College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China)