罗　宏范英姬　王海波　王　娟　张　艳　杜　倩

氧化苦参碱对人黑素细胞增殖与炎症因子自分泌的影响

罗宏☆范英姬王海波王娟张艳杜倩

目的： 明确氧化苦参碱（OMT）对黑素细胞增殖、TLR3、NF-κB的mRNA表达及相关细胞因子的影响。方法： 人表皮黑素细胞传代培养，分为空白对照组及不同浓度的氧化苦参碱组（10μmol/ L，50μmol/L和100μmol/L），用MTT法测定细胞增殖，RT-qPCR检测TLR3、NF-κB的mRNA表达，ELISA试剂盒检测IL-6、IL-8及IL-17表达。结果： 各组黑素细胞的吸光度值均显著高于空白对照组，随OMT浓度上升而升高，当OMT浓度为50μmol/L时增殖率达到平台期。OMT组TLR3及NF-κBmRNA及IL-6、IL-8及IL-17蛋白表达较对照组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：

氧化苦参碱可促进黑素细胞的增殖，下调TLR3、NF-κB的mRNA表达，减少IL-6、IL-8及IL-17的生成。

氧化苦参碱? 黑素细胞? TLR3? NF-κB

白癜风是皮肤科常见的色素障碍性疾病，本病参与机制复杂，临床上表现为发生于局部皮肤黏膜的色素减退或脱失性疾病。世界人群发病率为0.5%～1%，目前有逐年上升趋势［1］。免疫损伤是白癜风发病的关键步骤之一，而氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）具有较好的抗炎和免疫调节药理学效应，在呼吸、消化、血液等不同医学领域里发现OMT对NF-κB增殖抑制通路具有抑制作用，且其能减少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表达［2-4］。而且在过敏性皮肤病、色素异常性皮肤病等皮肤科多种疾病的临床应用中，苦参素皆可表现出稳定且安全的治疗效果。因此，在针对白癜风患者的治疗里，本研究欲寻求OMT是否可通过阻断TLR3-NF-κB增殖抑制通路，减轻炎症所致黑素细胞的凋亡，从而达到治疗效果呢?为此，我们进行了一系列细胞实验，用MTT、ELISA、RT-qPCR等方法检测了OMT处理黑素细胞后细胞的增殖情况，以及OMT对相关炎症因子的表达影响。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验细胞 收集我院外科门诊健康成人包皮环切术后手术标本，患者既往无白癜风，且无白癜风家族史，标本经患者知情后签署同意书，将黑素细胞分离及体外培养，使用第3代细胞进行实验。

1.1.2实验仪器与试剂配制 98%高纯度氧化苦参碱（中国药品生物制品检定所）：氧化苦参碱水溶性好，加入不同体积的蒸馏水分别溶解成10μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L浓度备用?核因子受体激活剂RANK（美国Sigma公司）：灭菌蒸馏水溶解配制成浓度为50 ng/mL［5］?Medium 254细胞培养基、生长因子HMGS、胎牛血清、PBS液（美国Gibco公司）?胰蛋白酶（上海碧云天）?二甲基亚砜、青霉素、链霉素（美国Sigma公司）?MTT粉（VETEC）?超净工作台（苏州安泰）?二氧化碳培养箱（德国Heraeus）?倒置显微镜（日本Olympus）?酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海西塘生物）?LightCycler480荧光定量PCR系统等。

1.2实验方法

1.2.1人表皮黑素细胞传代培养 将包皮组织去除皮下组织部分并分离成小块状，加入分离酶将表皮部分分离后，再添加胰蛋白酶消化制成细胞悬液，重复数次，用细胞计数板计数，按5×105个/mL密度接种于培养瓶，放入37℃、5%二氧化碳培养箱中过夜，每日观察细胞生长状态并及时换液。当细胞在瓶内铺壁约80%时，加入胰蛋白酶差别消化，提纯黑素细胞。传至第3代并通过测序验证的黑素细胞用于后续实验。

1.2.2实验分组 第3代黑素细胞贴壁80%左右时，胰蛋白酶消化后以1×105个/mL密度接种于96孔板过夜，次日弃去废液，空白对照组只加入新鲜培养基? OMT组分别加入含10μmol/L、50μmol/L、100μmol/ L这3种浓度的培养基各100μL，RANK组在OMT处理组基础上加入含50 ng/m L RANK的培养基100 μL，空白对照组则加入完全培养基100μL，每组设6复孔，将其放置二氧化碳培养箱内继续培养48 h。

1.2.3黑素细胞增殖率检测 结束培养后按照MTT步骤，各孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，放回培养箱孵育4 h，后去除上清，各孔加入DMSO 150μL，上摇床震荡10 min使结晶充分溶解。最后用酶标仪测各孔490 nm处光吸收度，重复三次并记录数据。细胞增殖率=（OMT组A490值-空白对照组A490值）/对照组A490值×100%。

1.2.4OMT促进黑素细胞增殖分子信号通路的检测选择能促进黑素细胞增殖最佳的OMT浓度（50 μmol/L），培育24 h后提取细胞总RNA。应用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板进行RT-qPCR荧光定量检测TLR3、NF-κB、IL-6、IL-8及IL-17 mRNA表达情况。引物序列见表1。引物由上海生工生物公司合成。

表1　目的基因及内参基因引物序列

1.2.5OMT对黑素细胞表面IL-6、IL-8及IL-17表达水平的检测 50μmol/L OMT培育各组细胞24 h后，按照酶联免疫试剂盒说明，取各组上清液检测IL -6、IL-8及IL-17的表达。

1.2.6NF-κB激动剂RANK对OMT处理下黑素细胞的影响 细胞培养方式同上，当黑素细胞接种至96孔板过夜后，次日弃去废液，加入含有50μmol/L OMT培养基培养24 h后，再加入NF-κB激动剂RANK（终浓度为50 ng/mL）继续培养24 h然后用RT -qPCR法检测TLR3、NF-κB的表达，用ELISA技术检测IL-6、IL-8及IL-17的表达情况。

1.2.7统计学方法 SPSS 18.0软件进行统计分析，数据用¯x±s表示，采用单因素方差分析及LSD-t检验，检验水准α=0.05，P<0.05为有统计学意义。

1.3结果

1.3.1MTT检测OMT对黑素细胞增殖的影响 通过MTT法测得各组细胞吸光度并计算细胞增殖率，行方差分析及LSD-t检验，加入OMT培养48 h后，各组黑素细胞的吸光度皆显著高于空白对照组，不同浓度OMT组间比较，细胞增殖趋势随OMT浓度上升而升高，当OMT浓度为50μmol/L时增殖率达到一个平台期（∗P<0.05?∗∗P>0.05）见图1。因此，后续实验选择培养时间48 h，50μmol/L OMT为实验浓度。

1.3.2RT-qPCR检测黑素细胞TLR3及NF-κB的mRNA表达 收集对照组、OMT处理组、OMT+RANK处理组细胞。TRIZOL法提取总RNA，逆转录后用RT -qPCR方法检测TLR3、NF-κBmRNA表达情况。所得结果如图2所示。我们可见，加入50μmol/L浓度的OMT后，黑素细胞TLR3、NF-κB mRNA表达水平显著降低，差异有统计学意义。加入NF-κB特异性激动剂RANK后，TLR3与NF-κB mRNA表达得到恢复。说明OMT可以介导TLR3-NF-κB通路，降低TLR3、NF-κB的mRNA表达。

∗P<0.05?∗∗P>0.05图1　MTT检测OMT对黑素细胞增殖的影响

图2　RT-qPCR检测OMT、RANK处理后，黑素细胞TLR3、NF -κB mRNA表达情况

1.3.3ELISA检测黑素细胞IL-6、IL-8及IL-17的表达 黑素细胞经不同处理后，应用相应的ELISA试剂盒测得上清液内IL-6、IL-8及IL-17的结果如表2所示。经方差分析可见，空白对照组相比，加入OMT的黑素细胞所表达出的炎症相关细胞因子IL-6、IL-8和IL-17均减少，差异有统计学意义。加入NF-κB特异性激动剂RANK后，IL-6、IL-8与IL-17的产生较OMT组明显升高。

表2　不同处理组对IL-6、IL-8及IL-17表达情况

2　讨论

白癜风是一种以黑素细胞丢失和白斑形成为特征的色素障碍性皮肤病，它的发病是多基因遗传、在多种环境刺激因子的激发下表现出免疫功能紊乱，表皮黑素细胞（melanocyte，MC）受到破坏，导致局限或泛发性色素脱失，最终在局部皮肤形成大小不等、数目不定的色素完全脱失斑［4，6］。它在我国人群患病率呈逐年上升的趋势，由于病程不定，病因不清，治疗困难，往往给患者带来心理负担。近年来，临床上对于白癜风，除光疗以外的大部分内科疗法采用免疫调节剂，细胞毒性药物以及外科自体黑素细胞移植［7］。但由于白癜风病因并不完全明确，部分患者同时合并其它自身免疫疾病，传统疗法具有一定疗效，但存在局限性。因此寻找靶向药物尤为重要。白癜风存在一定的免疫学基础、大量研究表明细胞免疫、体液免疫及相关细胞因子参与病情活动，其中以细胞免疫的效应较为突出，自身免疫介导的黑素细胞凋亡一直是关注的热点［8］。实验研究发现患者外周血及皮损区IL -1β、IL-6、IL-8、IL-17、及TNF-α等炎症因子的表达均显著上调［9，10］。这些炎症因子的表达增高，在趋化中性粒细胞至皮损区，促进白细胞与黑素细胞相互黏附，以及激活细胞毒T细胞等过程中发挥重要作用，从而加速免疫损伤推动疾病发展的进程。

已知由TLR3介导的T细胞依赖的B淋巴细胞激活，导致大量致病相关性抗体及细胞因子的产生，从而促使黑素细胞凋亡，是白癜风发病的主要原因之一。新近研究发现黑素细胞上可以表达功能性的TLRs，且TLR3通过激活NF-κB信号通路介导黑素细胞的凋亡［11］。TLRs主要表达在免疫细胞和多种炎症细胞表面，如树突状细胞（Dendritic cells，DC）、巨噬细胞和T、B细胞等，与其相应的配体结合后可以激活中性粒细胞等免疫细胞，使其分泌大量的炎性细胞因子和趋化因子，参与活化天然免疫应答和特异性免疫应答［12］。体内外实验研究发现抑制TLR3活性后黑素细胞的凋亡也逐渐减轻。通过转染针对TLR3的ShRNA慢病毒载体，抑制原代培养的黑素细胞中TLR3的表达。然后用流式细胞术检测下调TLR3表达黑素细胞凋亡情况发现，稳定转染shTLR3的黑素细胞受到poly（I：C）刺激后，其凋亡率明显降低，提示TLR3介导了dsRNA对黑素细胞的促凋亡效应。且TLR3活化后能诱导I型IFN（包括IFN-α和IFN-β）的释放，而I型IFN可以诱导黑素细胞凋亡途径的激活。临床治疗发现在一些接受I型干扰素治疗的患者中可以发生白癜风，说明TLR3信号通路在白癜风的诱发以及病情活动中可能发挥一定作用［13］。因此，靶向调控TLR3受体的功能将有助于调控黑素细胞介导的T、B细胞活化及T细胞介导的多种免疫应答功能，对特异性治疗白癜风具有重要的理论和临床意义。氧化苦参碱（Oxymatrine，OMT）具有较好的抗炎和免疫调节药理学效应，且在我们多年临床用药中发现OMT对白癜风具有良好的治疗作用［14］。在早期实验中，冯亚珍等［15］通过喂养小鼠实验发现OMT在小鼠体内具有抑制T细胞、B细胞和腹腔巨噬细胞的免疫功能活性作用。并且最新研究发现OMT对NF-κB凋亡信号通路具有抑制作用，且其能减少TNF-α、IL-1β等促炎因子的表达［2，14］。

本实验给黑素细胞加入一定浓度差的OMT后，黑素细胞的增殖较对照组显著提高。RT-qPCR检测TLR3及NF-κB mRNA则显示出OMT对其表达产生抑制作用，与熊永爱等研究结果一致。当加入NF-κB特异性激活剂RANK后，由PCR结果可见NF-κB以及TLR3的测值与空白组表达程度相似，说明OMT参与TLR3-NF-κB凋亡通路变化，并能拮抗RANK作用，靶向抑制细胞凋亡通路的激活，从而保护黑素细胞。随后我们进一步检测黑素细胞上清液的情况，IL -6、IL-8、IL-17在OMT加入后表达减少，当有RANK存在时，IL-6、IL-8、IL-17检测值接近空白组，说明IL-6、IL-8、IL-17参与TLR3-NF-κB凋亡通路，受通路正反馈调节，在细胞凋亡中发挥作用。加入50 μmol/L OMT后的黑素细胞数目比对照组显著增高，且TLR3-NF-κB及相关炎性细胞因子表达下降，可见OMT可能是通过抑制TLR3介导的T、B细胞活化，而抑制IL-6、IL-8、IL-17等炎症因子的产生，通过阻断TLR3-NF-κB凋亡通路，抑制黑素细胞的凋亡，从而保护黑素细胞。

本研究采用第3代黑素细胞，观察到OMT可抑制凋亡通路TLR3-NF-κB及减少相关细胞因子的产生，可见OMT能靶向调控黑素细胞上TLR3受体表达及其信号通路，将有助于从根源上治疗自身免疫性白癜风，这将是OMT在白癜风治疗领域的一大进展，但OMT临床上在何种条件及何种浓度时对白癜风患者达到满意疗效，还需进一步的动物及临床研究证实。

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（收稿：2015-12-05 修回：2016-01-05）

Influence of oxymatrine on themelanocyte proliferation and inflammation factor autocrine

LUO Hong，FAN Yingji，WANG Haibo，WANG Juan，ZHANG Yan，DU Qian. Chenzhou 3rd People's Hospital，Hunan 423000，China

LUO Hong，E-mail：3602677@qq.com

Objective：To determine the influence of oxymatrine（OMT）on the melanocyte proliferation and inflammation factor autocrine.M ethods：The cultured melanocytes were divided into blank group and oxymatrine groups with different concentrations（10μmol/L，50μmol/L and 100μmol/L）.The proliferation ofmelanocyte，mRNA of TLR3 and NF-κB and the expression of IL-6，IL-8 and IL-17 were detected by MTT method，RT-qPCR and ELISA respectively.Results：Absorbance values of the melanocytes in oxymatrinegroupswere higher than that in control group，in a concentration-dependentmanner.The proliferation rate reached a plateau when OMT concentration reached up to 50μmol/L.The expression of TLR3 and NF-κBmRNA and the proteins of IL-6，IL-8，IL-17 in OMT groups were significantly lower than those in control group（P<0.05）.Conclusion：OMT can increase the proliferation ofmelanocyte，down-regulate the expression of TLR3 and NF-κB mRNA and the protein of IL-6，IL-8 and IL-17.

oxymatrine?melanocyte?TLR3?NF-κB

湖南省卫生厅科研计划项目（编号：C2014-59）郴州市科技局计划项目（编号：CZ201314502）

郴州市第三人民医院，湖南郴州，423000

☆现工作单位：长沙市第一人民医院，410005

罗宏，E-mail：3602677@qq.com