王玉满，薛正莲，王　洲，苏燕南，朱　昊（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖　241000）

易错PCR提高粘质沙雷氏菌磷脂酶A1活性

王玉满，薛正莲∗，王洲，苏燕南，朱昊
（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000）

利用易错PCR技术对来自粘质沙雷氏菌PL-06的磷脂酶A1基因plaB进行定向改造，通过引入不同浓度Mg2+、Mn2+得到的易错PCR产物与表达型质粒p ET-28a（+）重组，构建磷脂酶A1突变文库，筛选出高酶活突变株EPB8.该突变酶相对野生酶酶活提高了22.5%，并对突变株EPB8产酶条件进行优化，优化后酶活较野生酶酶活提高41%.序列分析表明：plaB基因有11个碱基发生突变，导致7个氨基酸发生突变，其中磷脂酶A1蛋白有3个氨基酸突变，分别是Y97C、P98S、X228L，辅助蛋白有4个氨基酸突变，分别是P46L、Q58L、N136D、H233R.该实验结果为进一步在分子水平定向提高磷脂酶A1的活性奠定了基础，也为该酶在其他高表达系统中的表达提供了素材.

粘质沙雷氏菌；磷脂酶A1；易错PCR；产酶条件优化

磷脂酶A1是一类专一水解磷脂sn-1位酰基产生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶类［1］，可以用于植物脱胶和磷脂改性方面［2］，其水解产物溶血磷脂是优良的乳化剂、食品添加剂和抗菌剂，广泛运用在食品、化妆品、医药等各个方面［3］.随着磷脂酶的工业应用广泛，对其研究也日益增多.由于自然界筛选的菌株酶活不高、产量低，需进一步提高.随着分子技术水平的提高，与磷脂酶克隆表达相关的报道也随之增多.Michael Givskov［4］等提取液化沙雷氏菌磷脂酶A1基因在大肠杆菌克隆表达，但酶活不到1 U/m L.Jae Kwang Song［5］等……