曹 波， 尹海波， 贾晓晴， 邵 飞（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）



HPLC法同时测定3种老鹳草中7种成分

曹 波， 尹海波*， 贾晓晴， 邵 飞
（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的 建立HPLC法同时测定老鹳草Geranium wilfordii Maxim.、牻牛儿苗Erodium stephanianum W i11d.和野老鹳草Geranium carolinianum L.中没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、老鹳草素、鞣花酸、金丝桃苷和槲皮素的含有量。方法 分析采用Agi1ent 5TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱；体积流量1 mL/min；检测波长280 nm（0～32 min）、360 nm（32～62 min）；柱温30℃。SPSS17.0软件进行数据分析。结果3种老鹳草中7种成分含有量均依次为老鹳草素＞柯里拉京＞鞣花酸＞没食子酸＞原儿茶酸＞金丝桃苷＞槲皮素。其中，没食子酸、槲皮素含有量呈显著性差异 （P＜0.05）。结论 7种成分含有量在牻牛儿苗和野老鹳草中相近，而在老鹳草中较低。

老鹳草；牻牛儿苗；野老鹳草；化学成分；HPLC

老鹳草药材始见于 《滇南本草》［1］，《中国药典》2015版规定其有3种不同来源，分别为牻牛儿苗Erodium stephanianum Wi11d.、老鹳草Geranium wilfordii Maxim.和野老鹳草Geranium carolinianum L.［2］，其主要化学成分包括黄酮、鞣质、有机酸和挥发油［3-4］。目前，对老鹳草药材进行含有量测定的报道很多［5-10］，但鲜有对这3种老鹳草多指标成分测定及比较的研究［11］。为了能够更加全面有效地评价三者的质量，本实验采用HPLC法同时测定老鹳草药材中7种活性成分没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、老鹳草素、鞣花酸、金丝桃苷和槲皮素的含有量。

1　仪器与试药

Agi1ent1100色谱仪，包括Chemstation化学工作站（美国Agi1ent公司）；电子天平（德国Sartorius公司）；超声清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。没食子酸、原儿茶酸、槲皮素 （中国食品药品检定研究院，批号分别为 110831-200302、110809-200604、100081-200406）；柯里拉京、金丝桃苷 （上海源叶生物科技有限公司，批号分别为PM0529SA14、RA0504FA14）；老鹳草素、鞣花酸 （上海融禾医药科技有限公司，批号分别为100503、091227）。乙腈、磷酸为色谱纯 （天津市科密欧化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯；水为市售哇哈哈纯净水。21批药材均为野生，经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定分别为老鹳草G.wilfordii、牻牛儿苗E.stephanianum、野老鹳草G.carolinianum，样品信息见表1。

表1　样品信息Tab.1 Information of sam p les

2　方法与结果

2.1试样的制备及色谱条件

2.1.1对照品溶液的制备［12］称取没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、老鹳草素、金丝桃苷、槲皮素对照品1.25、0.59、8.95、11.8、0.65、0.13mg，置于10 m L棕色量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀，即得混合对照品溶液。另称取干燥至恒重的鞣花酸对照品7.25 mg，置于5 mL棕色量瓶中，二甲基亚砜溶解并定容［13］，摇匀，即得。

2.1.2供试品溶液的制备［12］精密称取3种老鹳草药材粉末 （40目）2 g，置于圆底烧瓶中，并加入200 mL甲醇，回流提取1 h，共2次，合并滤液蒸干，甲醇定容至25 m L棕色量瓶中，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3色谱条件 Agi1ent 5TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈 （A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脱 （0～10 min，4%～5%A；10～15 min，5%～12%A；15～20 min，12%～14%A；20～30 min，14%～15%A；30～40 min，15%～21%A；40～50 min，21%A；50～60 min，21%～45%A；60～62 min，45%A）；柱温30℃；检测波长280 nm（0～32min）和360 nm（32～62 min）；体积流量1 mL/min；进样量10μL。色谱图见图1。

图1　HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2方法学考察

2.2.1线性关系 精密量取混合和鞣花酸对照品溶液各2.5 mL，置于5 mL棕色量瓶中，甲醇和二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，连续稀释4次，即得一系列质量浓度溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样10μL分析。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，结果见表2。

表2　7种成分的标准曲线Tab.2 Standard curves of seven constituents

2.2.2精密度试验 分别取同一混合及鞣花酸对照品溶液，在 “2.1.3”项条件下重复进样6次，测得没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、老鹳草素、鞣花酸、金丝桃苷、槲皮素峰面积RSD分别为1.66%、 1.83%、 1.74%、1.55%、1.28%、1.69%、1.77%，表明仪器精密度良好。

2.2.3稳定性试验 将供试品溶液 （S20）置于室温下，于0、2、4、6、8、10 h进样检测，测得没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、老鹳草素、鞣花酸、金丝桃苷、槲皮素峰面积RSD分别为1.59%、1.70%、 1.29%、 1.54%、1.12%、1.88%、1.59%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.2.4重复性试验 精密称取药材粉末 （S20）6份，按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3”项条件下测定，测得没食子酸、原儿茶酸、柯里拉京、老鹳草素、鞣花酸、金丝桃苷、槲皮素峰面积RSD分别为1.47%、1.70%、1.20%、1.56%、1.04%、1.62%、1.53%，表明该方法重复性良好。

2.2.5加样回收率试验 精密称取含有量已知的样品药材 （S20）9份，每份1 g，每3份为1组，每组按低、中、高质量浓度分别加入相当于药材含有量50%、100%、150%的对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1.3”项色谱条件下分析，结果见表3。

2.3结果与分析

2.3.1含有量测定 精密吸取供试品溶液10μL，在“2.1.3”项色谱条件下测定，结果见表4和图2。

表3　加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests

表4　含有量测定结果（mg/g）Tab.4 Results of content determ ination（mg/g）

2.3.2各成分含有量及总含有量平均值的比较

见图3～4，采用SPSS 17.0软件，对3种老鹳草中7种成分含有量进行统计学分析。结果表明，仅原儿茶酸（P=0.433＞0.05）、鞣花酸（P=0.374＞0.05）、槲皮素 （P=0.063＞0.05）符合正态分布。将三者进行方差齐性检验，发现原儿茶酸（P=0.269＞0.05）、鞣花酸 （P=0.804＞0.05）、槲皮素 （P=0.698＞0.05）均满足，再进行方差分析，结果见表5～6。将不符合正态分布的其他4种成分进行Kruska1-Wa11is检验，结果见表7。

图2　各成分含有量折线图Fig.2 Line graphs of contents of various constituents

图3　各成分含有量平均值直观图Fig.3 Visual diagram s of average contents of various constituen ts

图4　各成分总含有量平均值直观图Fig.4 Visual diagram s of average total conten ts of various constituen ts

3　讨论与结论

由图2可知，3种老鹳草中7种成分含有量由高到低，依次为老鹳草素、柯里拉京、鞣花酸、没食子酸、原儿茶酸、金丝桃苷、槲皮素。其中，金丝桃苷和槲皮素为黄酮类成分，其他均为鞣质类成分。由图3和图4可知，不同产地老鹳草中各成分含有量平均值低于牻牛儿苗和野老鹳草，其总含有量平均值差异更明显，而牻牛儿苗和野老鹳草基本相近。因此，老鹳草的质量可能不如其他2种。

表5　方差分析Tab.5 Analysis of variance

表6　多重比较结果Tab.6 Results of multip le com parisons

表7　非参数检验结果Tab.7 Results of non-parametric tests

采用SPSS17.0统计软件，对3种老鹳草中7种成分含有量进行分析，发现三者没食子酸 （P= 0.039＜0.05，表7）、槲皮素 （P=0.038＜0.05，表5）存在明显差异。再对槲皮素成分进行多重比较分析，发现野老鹳草与老鹳草 （P=0.021＜0.05，表6）、牻牛儿苗 （P=0.032＜0.05，表6）组间差异有统计学意义，结合槲皮素含有量平均值（野老鹳草0.150 mg/g、老鹳草0.077 mg/g、牻牛儿苗0.083 mg/g）可知，野老鹳草中槲皮素成分含有量高于其他2种。

综上所述，本实验以7种成分含有量为指标，采用HPLC法对3种老鹳草进行定量比较研究，可为 《中国药典》中该药材用药的准确性以及质量标准的制定提供一定参考依据。

［1］明·兰 茂.滇南本草：第1卷［M］.昆明：云南人民出版社，1959：120-125.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：122.

［3］周海燕.老鹳草的研究概况［J］.国外医药：植物药分册，1996，11（4）：164.

［4］杜晓鸣.老鹳草素（Geraniin）及其抗氧化作用［J］.国外医药：植物药分册，1990（2）：57.

［5］金 欣，王 锋，姚 岚，等.HPLC测定野老鹳草中没食子酸和鞣花酸的总量［J］.中成药，2010，32（7）：1172-1176.

［6］Wu Q Y，Zhou Y，Jin X，et al.Chromatographic fingerprint and the simu1taneous determination of five bioactive components of Geranium carolinianum L.water extract by high performance 1iquid chromatography［J］.Int J Mol Sci，2011，12（12）：8740-8749.

［7］吕文龙.HPLC法测定老鹳草中没食子酸的含量［J］.中国保健营养，2013，23（1）：367.

［8］尹海波，赵晓雨，涂秀文，等.不同采收时期牻牛儿苗中4种酚酸类活性成分的动态分析［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（13）：121-124.

［9］王洪成，尹海波，曹 波，等.HPLC同时测定不同产地野老鹳草中5种活性成分含量［J］.辽宁中医杂志，2015，42（4）：834-836.

［10］周公颂，孙若飞，李笑然，等.不同产地老鹳草中有效成分的测定［J］.华西药学杂志，2015，30（4）：465-468.

［11］许 敏，陈 颖，段素敏，等.HPLC法测定3种老鹳草药材中没食子酸和柯里拉京的含量［J］.中国野生植物资源，2013，32（6）：39-42.

［12］曹 波，尹海波.三种正品老鹳草HPLC指纹图谱比较研究［C］//第四届中国中药商品学术大会暨中药鉴定学科教学改革与教材建设研讨会论文集.北京：中国商品学会，2015：101-106.

［13］王吉华，尹海波.正交试验法优选老鹳草酚酸类成分的提取工艺［J］.中药材，2012，35（6）：986-989.

Simultaneous determ ination of seven constituents in three kinds of cranesbill by HPLC

CAO Bo， YIN Hai-bo*， JIA Xiao-qing， SHAO Fei
（School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional ChineseMedicine，Dalian 116600，China）

AIM To estab1ish an HPLCmethod for simu1taneous determining the contents of ga11ic acid，protocatechuic acid，cori1agin，geraniin，e11agic acid，hyperoside and quercetin in Geranium wilfordii Maxim.，Erodium stephanianum Wi11d.and Geranium carolinianum L..METHODS The ana1ysiswas performed on an Agi1ent C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5μm），mobi1e phase was acetonitri1e-0.1%H3PO4with gradient e1ution，f1ow rate was 1 mL/min，detection wave1engths were set at 280 nm（0-32 min）and 360 nm（32-62 min），and co1-umn temperature wasmaintaned at30℃.SPSS17.0 software was used for data ana1ysis.RESULTS The contents of seven constituents in three kinds of cranesbi11were a11 in sequence of geraniin＞cori1agin＞e11agic acid＞ga11ic acid＞protocatechuic acid＞hyperoside＞quercetin.Among them，the contents of ga11ic acid and quercetin showed significant differeces（P＜0.05）.CONCLUSION The contents of seven constituents are simi1ar in E. stephanianum and G.carolinianum，which are 1ower in G.wilfordii.

Geranium wilfordii Maxim.；Erodium stephanianum Wi11d.；Geranium carolinianum L.；chemica1 constituents；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1338-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.027

2015-10-25

中医药行业科研专项 （201407002）

曹 波 （1990—），女，硕士生，研究方向为种质资源鉴定及中药品质评价。Te1：13998416323，E-mai1：1156034502@ qq.com

尹海波 （1973—），男，博士，教授，研究方向为种质资源鉴定及中药品质评价。Te1：（0411）87586003，E-mai1：yhb0528@sina.com