马 琳， 张耀洲*， 唐楚沉（.天津大学药物科学与技术学院，天津30007；.浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州3008）



超声提取麻花秦艽花中龙胆苦苷的最佳工艺

马 琳1， 张耀洲1*， 唐楚沉2
（1.天津大学药物科学与技术学院，天津300072；2.浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州310018）

目的 研究麻花秦艽花中龙胆苦苷的最佳超声提取工艺。方法 采用UPLC结合响应面法对麻花秦艽花中龙胆苦苷超声提取工艺进行优化。结果 最佳条件为提取时间80min，料液比1∶24，甲醇体积分数93%，提取3次。供试液中龙胆苦苷峰面积的实测值为2 164.60，与预测值 （2 120.64）相差仅2.05%。结论 该模型预测性良好，而且优化条件可靠。

麻花秦艽花；龙胆苦苷；超声提取；UPLC；响应曲面法

麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.为多年生草本，属龙胆科龙胆属秦艽组，主要分布于陕西、甘肃、四川、青海和内蒙古等地，大多生长于高山草甸、山地草场、亚高山或高山灌丛和林园阳坡等地［1］。该植物以花入药，性味苦、平，有祛风湿、清湿热、止麻痹等功效，临床上用于治疗风湿痹痛、筋脉痉挛、日曝潮热和小儿疮积发热等症［2-3］。药理研究表明，秦艽中含有以龙胆苦苷为代表的环烯醚萜苷类活性成分，对风湿性关节炎有显著疗效，可治疗消化不良，对多种肝损伤起到保护作用，还具有利胆、利尿、抗菌、抗炎、抗过敏、抗病原虫、退热镇痛、抗肿瘤及减轻CC14毒性等活性［4-6］。为合理开发利用这一药材资源，最大限度地提取其有效成分，本实验在预实验基础上，以提取时间、料液比和甲醇体积分数3个因素为影响因子，应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，以供试液中龙胆苦苷的峰面积为响应值，得到龙胆苦苷超声提取的最佳工艺。

1　仪器、试剂与材料

1.1仪器 Acquity UPLC色谱仪，包括Acquity UPLC PDA检测器、Empower 2色谱工作站（美国Waters公司）；AL204型电子天平 （梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）；JP300型超声提取器 （武汉嘉鹏电子有限公司）。

1.2试剂 龙胆苦苷对照品 （中国食品药品检定研究院，批号1107702200308，纯度＞98%，20mg/支）；UPLC用甲醇 （色谱纯）、提取用甲醇 （分析纯）（天津康科德试剂有限公司）。

1.3材料 麻花秦艽花于2013年购自陕西省汉中药材市场，经中国科学院西北高原生物研究所王启兰副研究员鉴定为龙胆属植物麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.的花。60℃下干燥，粉碎，过40目筛，密封备用。

2　方法与结果

2.1色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm× 2.1mm，1.7μm）；柱温40℃；样品室温度8℃；流动相为甲醇∶水 （30∶70）；检测波长270 nm；进样量3μL。

2.2对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品55mg，置于100 mL烧杯中，适量色谱纯甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，色谱纯甲醇定容，摇匀，即得5.5 mg/mL对照品溶液，备用。

2.3标准曲线的制备 精密吸取 “2.2”项下对照品溶液1、3、5、7、9μL，在 “2.1”项色谱条件下依次进样，以进样量为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y），得到回归方程Y=1 266.84X+1.04（r2=1），表明龙胆苦苷在5.5～49.5μg范围内呈良好的线性关系。

2.4样品的提取 根据预实验结果，确定提取次数为3次。根据中心组合试验设计原理，选择提取时间 （X1）、料液比 （X2）和甲醇体积分数 （X3）作为考察因素，每个因素3个水平。见表1。

表1　因素水平

取密封保存的麻花秦艽花粉末1.00 g，超声提取，过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压干燥，干浸膏用甲醇超声溶解，转移到25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22μm微孔滤膜过滤，作为供试样品溶液。对照品及样品色谱图分别见图1和图2。

图1　龙胆苦苷对照品

图2　麻花秦艽花样品

2.5响应面试验 采用Box-Behnken试验设计方案，以供试液样品溶液中龙胆苦苷的峰面积值 （Y）为响应值，共设计17组试验，Design Expert 7.0.0软件对龙胆苦苷提取工艺进行优化［7-9］。结果见表2。

2.6响应面试验结果分析

2.6.1供试液中龙胆苦苷的峰面积回归模型的建立及显著性检验 Design Expert7.0.0软件对试验数据进行多元回归和二项式拟合，得到回归方程

表2　Box-Behnken试验设计与结果

对该回归模型进行方差分析，结果见表3，发现线性关系显著 （r=0.978 6）；模型显著水平P＜0.000 1，说明该模型非常显著；模型失拟项P=0.38＞0.000 5不显著，表明该方程拟合度良好，误差小。因此，可用该回归方程代替试验真实点来进行分析和预测。X2的F值小于0.000 1，表明其对龙胆苦苷提取的影响非常显著；X3的F值小于0.001，表明影响很显著；X1的F值小于0.01，表明影响较显著。各二次项因素按影响大小排序，依次为；交互项按影响大小排序，依次为 X2X3、 X1X3、X1X2，表明各因素对龙胆苦苷提取的影响不是简单的线性关系，响应曲面图见图4～6。

表3　方差分析

2.6.2响应面及等高线分析 图3A～5A是提取时间、甲醇体积分数和料液比的响应面图，可反映出任意两因素及其交互作用对麻花秦艽花中龙胆苦苷提取的影响。回归方程在所选范围的极大值可以用响应面曲线图的最高点标示，而两个变量之间的交互作用是否显著可以从等高线 （图3B～5B）的形状来判断。等高线图越趋近于圆形，表示交互作用越不显著；越趋于椭圆形，表示交互作用越强［10］。

图3　提取时间和甲醇体积分数对龙胆苦苷的影响

图4　料液比和提取时间对龙胆苦苷的影响

为了确定龙胆苦苷最佳的提取工艺，利用Design Expert7.0.0软件对响应面试验结果作进一步优化，以龙胆苦苷峰面积为指标，得到最佳条件为提取时间80 min，料液比1∶24，甲醇体积分数93%。此条件下，龙胆苦苷峰面积为2 120.64。

图5　甲醇体积分数和料液比对龙胆苦苷的影响

2.7最佳工艺条件验证 平行试验3次，结果见表4。由表可知，该模型预测性良好 （与预测值2 120.64相差仅2.05%），优化工艺条件可靠。

表4　验证实验结果

3　讨论

本实验采用UPLC法对麻花秦艽花药材中龙胆苦苷的含有量进行测定，与常用的HPLC法相比，在保持较高准确度和精密度的同时，还提高了分析效率。同样流动相下，龙胆苦苷的保留时间从9.8min锐减到2.5 min，分析时间大幅度缩短，从而减少了溶剂损耗及废液处理成本，可为麻花秦艽花的质量控制及相关产品的开发利用提供一种更快捷、精准的测定方法。

同时，采用Box-Behnken响应面法对提取工艺进行了优化，所得最佳条件 （提取时间80 min，料液比1∶24，甲醇体积分数93%，提取3次）与实际结果的吻合性较好，说明该方法在操作上可靠，而且重复性良好。

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R284.2

B

1001-1528（2016）06-1412-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.046

2015-04-20

马 琳 （1990—），女，硕士生，研究方向为天然产物分离与提取。E-mai1：yuyu88196@163.com

张耀洲 （1964—），男，教授，研究方向为生物化学与分子生物学、天然产物分离与提取。E-mai1：zyz_tjedu@126.com