付文君， 魏江平， 任香怡， 陈 欢， 付 昆， 罗晓红， 徐世军*（1.四川省中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.成都中医药大学，四川成都611137）



［科研报道］

益胃汤对EM s模型大鼠异位子宫内膜Notch1、Delta1和Jagged1表达的影响

付文君1，2， 魏江平1，2， 任香怡1，2， 陈 欢1，2， 付 昆1，2， 罗晓红2*， 徐世军1，2*
（1.四川省中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.成都中医药大学，四川成都611137）

目的 考察益胃汤对自体移植子宫内膜异位症（EMs）大鼠异位内膜Notch1、De1ta1及Jagged1表达的影响，为其干预EMs提供依据。方法 建立SD大鼠自体移植EMs模型，将造模成功的大鼠随机分成模型对照组，丹那唑组（0.20 g/kg），益胃汤高 （27.00 g/kg）、中 （13.50 g/kg）、低剂量 （6.75 g/kg）组，药物连续干预4周后，测量异位子宫内膜体积，并采用Western b1ot法检测各组动物子宫内膜中NOTCH1蛋白表达；采用免疫组化法检测各组大鼠内膜DELTA1及JAGGED1蛋白表达。结果 与模型对照组比较，益胃汤给药后，EMs模型大鼠异位子宫内膜体积显著缩小（P＜0.01），益胃汤高剂量大鼠异位内膜中NOTCH1相对表达量和DELTAL1平均光密度显著减少 （P＜0.01）；益胃汤高、中剂量组中JAGGED1平均光密度明显降低 （P＜0.05）。结论 益胃汤改善EMs与降低异位子宫内膜Notch1、De1ta1和Jagged1的表达有关。

益胃汤；子宫内膜异位症；Notch1；De1ta1；Jagged1

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种异位子宫内膜含腺体和间质的雌激素依赖型慢性妇科疾病，其病变主要因涉及免疫细胞免疫学异常等［1-2］，而被认为是自身免疫类疾病。大量研究也表明EMs患者腹腔液及EMs模型动物外周血中辅助性T细胞 （Th细胞）及其分泌的细胞因子异常［3-4］。而Th细胞的分化与Notch信号密切相关，其中Notch1受体及Notch配体De1ta1和Jagged1在免疫细胞和上皮细胞［5-8］的分化过程中具有重要作用，因此这三者可能在EMs病变过程中扮演重要角色。课题组前期已证明益胃汤具有改善EMs模型大鼠病变作用，且其干预作用可能与调节免疫有关［9-11］，但它是否通过调节Notch1、De1ta11和Jagged1的表达而干预EMs还不清楚且也尚无相关文献报道，因此本实验拟通过检测益胃汤干预后的EMs模型大鼠异位子宫内膜Notch1、De1ta1和Jagged1的表达，探索其改善EMs的潜在作用机制。

1　材料与方法

1.1实验药物 益胃汤［8］组成及用量均采用上海中医药大学1982年版 《中医方剂与临床》，成人日用量为81 g，则成人 （以60 kg体质量计算）用量的10倍剂量为大鼠给药的中剂量。沙参、麦冬、生地、玉竹均购于成都福利大药房，经成都中医药大学生药教研室马云桐博士鉴定为药典品种。上述4味药均加入8倍量水，武火煎煮至沸腾后改文火煎30 min，取汁，加入冰糖，浓缩至2.7 g/mL的水煎液，4℃保存备用。丹那唑胶囊，批号：20140402（江苏联环药业股份有限公司）；乙烯雌酚 （标准品）（大连美仑生物技术有限公司）。

1.2实验动物 SPF级SD大鼠，雌性，体质量180～220 g，成都达硕实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（川）2013-24。实验场地为国家中医药管理局成都中医药大学中药药理三级实验室，编号：TCM2032043。大鼠均在室温22～24℃，明暗周期12 h/12 h条件下，自由饮水摄食。

1.3试剂 NOTCH1抗体，兔多克隆抗体（一抗），批号ab33932（英国Abcam—艾博抗 ［上海］贸易有限公司）；DELTA1抗体和JAGGED1抗体（一抗），批号分别为bs-7345R和bs-1448R（北京博奥森生物技术有限公司）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（二抗），批号13152A11（北京中衫金桥生物有限公司）等。

1.4仪器 PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威医疗仪器有限公司）；BA200Digita数码三目摄像显微摄像系统（麦克奥迪实业集团有限公司）；Image-Pro P1us 6.0（美国Media Cybernetics）图像分析系统；UV Transi11uminator化学发光凝胶成像仪、ChemiDoc XRS+Systems凝胶扫描成像仪、Image Lab凝胶分析系统均为美国BIO-RAD公司产品。

1.5方法

1.5.1造模、分组及给药 参照文献 ［9］方法稍加改善进行 EMs动物造模，即每只大鼠以乙烯雌酚溶液（0.02mg/kg）连续灌胃3 d后，采用水合氯醛溶液（3.2mg/kg）麻醉，固定，备皮后常规消毒，开腹，游离右侧子宫，距子宫卵巢1～2 cm处一次性结扎一段子宫，游离子宫段并立即置于盛有生理盐水的培养皿中，沿系膜部剪开切成5mm×5 mm的子宫片段。将其平整放置于腹肌与皮下筋膜层之间开凿的隧道中，内膜面紧贴腹肌，用细线连同筋膜层和内膜固定两角于腹肌上，避免内膜卷曲。逐层缝合关腹，缝合处1 mL注射器滴加4～5滴庆大霉素注射液并肌注 （1mL/kg）防止感染。术后第2天开始灌服上述乙烯雌酚溶液促进移植内膜生长并继续肌注庆大霉素注射液，两者均1次/d，连续3 d。假手术组大鼠开腹后再相同位置结扎，剪去同等长度子宫不用，其他处理过程同上。常规饲养，每周触摸观察内膜包块生长情况。造模第4周后，开腹观察，用游标卡尺测量内膜包块的体积 （长×宽×高mm3），当包块体积增大≥8 mm3，肉眼观察包块内出现液体积聚，呈隆起透亮的小囊状，结缔组织覆盖并有血管形成，即为造模成功［10］。造模成功动物随机分成模型对照组、丹那唑组（0.20 g/kg）、益胃汤高 （27.00 g/kg）、中（13.50 g/kg）、低 （6.75 g/kg）3个剂量组，每组9只。每天灌胃一次，给药体积10 mL/kg，模型对照组给予等体积生理盐水，连续灌胃30 d。

1.5.2Western b1ot法检测NOTCH1蛋白表达 末次给药24 h后，脱臼处死大鼠，开腹暴露移植内膜，测量体积后剪取部分内膜并置于10%中性甲醛溶液中固定用于免疫组化的检测，剩余部分于液氮冻存后用于Western b1ot的检测。样本蛋白经8%～10%的SDS-PAGE分离胶分离后转入硝酸纤维素膜，一抗 （稀释浓度，NOTCH1为1∶200；β-Actin为1∶5 000）4℃孵育过夜，二抗 （稀释浓度：1∶5 000）室温孵育3 h。洗膜、显影定影后，Image Lab凝胶分析系统扫描分析，结果以目的蛋白相对表达量 （目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值（IOD）/内参积分光密度值（IOD）表示。

1.5.3免疫组化法检测DELTA1及JAGGED1蛋白表达

常规免疫组化法操作［11］，采用BA200Digita1数码三目摄像显微摄像系统显微摄像系统从每张制好的片子中选取1～3个区域，400倍采集图像，再用Image-Pro P1us 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的平均光密度，若每张切片采集多张图像，则取平均值。所有平均光密度 （AOD）值测定均在相同的光学条件下完成。阳性为棕黄色-黄色表达于细胞浆、细胞膜或间质，阴性细胞核为蓝色。

2　结果

2.1益胃汤对各组大鼠异位子宫内膜体积的影响 给药后，给药组与模型对照组比较，各给药组实验大鼠异位子宫内膜体积显著缩小 （P＜0.01），益胃汤对EMs模型大鼠异位子宫内膜体积抑制率为46.35%～77.05%，结果见表1。

表1　各组大鼠给药前后异位子宫内膜体积变化 （n=9，±s）

表1　各组大鼠给药前后异位子宫内膜体积变化 （n=9，±s）

注：与模型对照组比较，**P＜0.01

组 别　　剂量/（g·kg-1）异位子宫内膜体积/mm3抑制率/给药前　　给药后%模型对照组-　90.74±54.63 101.3±53.54　-丹那唑组　0.20　92.60±75.98 17.92±7.589**　80.65益胃汤高剂量组　27.0　103.6±70.56　23.78±14.46**　77.05益胃汤中剂量组　13.5　74.73±53.85 38.26±33.16**　48.80益胃汤低剂量组　6.75　84.68±51.21　45.43±28.24**46.35

2.2益胃汤对各组异位子宫内膜NOTCH1蛋白表达的影响

Western b1ot检测结果显示，上条带为NOTCH1，下条带为β-Actin，见图1；与模型对照组比较，益胃汤给药组NOTCH1蛋白相对表达量降低，其中益胃汤高剂量组显著抑制NOTCH1蛋白表达，具有统计学意义 （P＜0.01），见图2。

图1　各组异位子宫内膜NOTCH1蛋白水平的W estern blot原始记录图（n=9，±s）

2.3益胃汤对模型大鼠异位子宫内膜DELTA1和JAGGED1蛋白表达的影响 DELTA1和JAGGED1表达于子宫内膜上皮细胞、间质细胞的胞膜和胞浆中，阳性表达为浅黄色或棕黄色，阴性表达为蓝色。由图3～4可知，模型对照组异位子宫内膜DELTA1和JAGGED1免疫染色呈黄色，阳性表达较高；给药组异位子宫内膜DELTA1和JAGGED1免疫染色较模型对照组，阳性表达降低，呈蓝色阴性表达，益胃汤各剂量组阳性表达均降低；由图5～6可知，高剂量组DELTA1平均光密度明显低于模型对照组 （P＜0.01），其余两个剂量组差异无统计学意义 （P＞0.05）；高剂量组和中剂量组JAGGED1平均光密度明显低于模型对照组（P＜0.01，P＜0.05）。

图2　NOTCH 1在各组大鼠异位子宫内膜中的相对表达量（n=9，±s）

图3　益胃汤对异位子宫内膜DELTA1蛋白表达的影响（×400）

图4　益胃汤对异位子宫内膜JAGGED1蛋白表达的影响（×400）

3　讨论

子宫内膜异位症是一种多发于育龄阶段的常见妇科疾病，大量研究认为它的发病机制与患体免疫异常有关，而免疫淋巴T、B细胞的分化与Notch信号密不可分［7］，Notch信号是一种多细胞生物体进化上保守的信号通路，哺乳动物体内存在4种Notch受体（Notch1～4）和Jagged1～2、De1ta1，3，4等11种配体，Notch信号经各细胞之间细胞膜上的受体和配体接触传导，Notch受体在相关酶的作用下释放出Notch细胞内源性结构域（notch intrace11u1ar domain， NICD），它再转移至细胞核内将信号传给其他下游蛋白［12］，其时空表达效应（tempora1-spatia1expression effects）对细胞的增殖、分化、凋亡等生物过程具有重要作用。其中Notch1信号可促进CD4+、CD8+双阳性T细胞在骨髓中呈胸腺非依赖性发育［13］，De1ta1和Jagged1，对人类淋巴细胞以及子宫内膜柱状上皮细胞等上皮细胞的分化都具有直接影响［8］，并且它们还可分别诱导Th1和Th2的形成［14-15］，间接影响机体Th细胞分泌的炎性细胞因子水平的变化。结果显示：益胃汤干预后可显著降低EMs模型大鼠异位子宫内膜体积，说明益胃汤可有效抑制异位内膜生长；模型对照组异位内膜NOTCH1、DELTA1和JAGGED1的表达均明显升高，进而引起EMs患体外周血Th细胞比率增加［16-17］和Th细胞分泌的炎症因子血清或腹腔液水平［3］上升和下降，说明EMs的形成与Notch信号有关。益胃汤能明显降低EMs模型大鼠异位子宫内膜NOTCH1、DELTA1和JAGGED1的表达，表明益胃汤改善EMs可能与其下调NOTCH1、DELTA1和JAGGED1的表达有关，而它对Notch信号的其他受体及配体有无调节作用还有待于进一步研究。

图5　DELTA1在各组大鼠异位内膜中的平均光密度（n=9，±s）

图6　JAGGED1在各组大鼠异位内膜中的平均光密度（n=9，±s）

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R285.5

B

1001-1528（2016）06-1372-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.035

2015-08-06

成都市科技局一般项目 （12DXYB270）

付文君 （1992—），女，硕士生，从事中药神经与精神药理学研究。Te1：（028）61800231，E-mai1：fwj10330@163.com

罗晓红 （1966—），女，教授，从事妇科疾病的教学、科研及临床工作。Te1：（028）85080790，E-mai1：y1uoxiaohong88@ 126.com徐世军 （1975—），男，教授，从事中药神经与精神药理学研究。Te1：（028）61800231，E-mai1：docxu@126.com