邓红梅,叶燕娜(广东石油化工学院果蔬加工与保藏开发中心,广东茂名　525000)

玉米苞叶总黄酮超声波辅助提取的响应面优化及其抗氧化测定

邓红梅,叶燕娜
(广东石油化工学院果蔬加工与保藏开发中心,广东茂名525000)

采用响应面分析法优化超声波辅助乙醇提取玉米苞叶总黄酮,利用BoxGBehnken组合设计研究了料液比、乙醇质量分数、超声波处理时间、水浴时间4个因素对黄酮提取率的影响.结果表明,玉米苞叶黄酮提取的最佳工艺条件为:乙醇质量分数为80%,料液比为1∶26,超声波处理时间为40 min,水浴时间为34 min.进一步对玉米苞叶总黄酮的抗氧化性进行测定,结果表明:玉米苞叶中总黄酮对DPPH自由基的清除能力和还原能力大于维生素C.

超声波;玉米苞叶;黄酮;抗氧化

引用格式:Deng Hongmei,Ye Yanna．Measurement on Response Surface Optimization and Antioxidation of UlG trasoundGassisted Extraction of Total CornGbract Flavonoids[J]．Journal of Gansu Sciences,2016,28(2):38G43．[邓红梅,叶燕娜．玉米苞叶总黄酮超声波辅助提取的响应面优化及其抗氧化测定[J]．甘肃科学学报,2016,28(2):38G43．] doi:10．16468/j．cnkii．ssn1004G0366．2016．02．009．

黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心血管疾病等作用,是一种天然的抗氧化剂[1G4].最早研究玉米黄酮类化合物是以花粉为原料,但用玉米花粉作为原料提取黄酮类化合物会影响玉米受精[5],继而影响玉米的产量,而利用丢弃的成熟玉米苞叶作为原料不仅不影响玉米受精,而且废物利用,避免环境污染,具有很好的发展前景.超声波辅助提取(UAE,ultrasoundGassisG ted extraction)技术是目前常用于天然产物提取的一种方法,具有提取时间短、避免提取物分解的特点.从玉米苞叶中提取黄酮类化合物成本低,研究响应面法优化超声波辅助乙醇提取玉米苞叶总黄酮工艺,可为玉米苞叶综合利用提供一条新的途径.

1　材料与方法

1．1材料、试剂和设备

材料:玉米苞叶,收集于茂名市茂南区官渡市场.选择新鲜的、颜色浅的,干燥粉碎过40目筛.

试剂:芦丁标准品、2G二苯基G2G苦味酰自由基(DPPHű)标准品、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、三氯化铁、抗坏血酸、邻苯三酚、铁氰化钾等,均为分析纯.

仪器:AUY220分析天平,DKGS24电热恒温水浴锅,LG550台式离心机,UVG2600紫外可见光光度计,KQ5200DE型超声波清洗器,VG5000型722分光光度仪.

1．2试验方法

(1)玉米苞叶黄酮的提取流程玉米苞叶→洗净晒干→真空干燥24 h→粉碎(40目)→称样(1 g)→加提取剂(乙醇)→超声波处理→水浴恒温提取→真空抽滤→萃取叶绿素(石油醚)→总黄酮.

(2)玉米苞叶黄酮含量测定标准曲线的绘制[6]:利用黄酮与铝离子在碱性和亚硝酸存在的条件下生成稳定的色泽,用芦丁标准品做标准曲线,得出芦丁含量(x)与吸光度(y)之间的线性回归方程为y＝118．74x－0．004 5,R2＝0．999 7.

黄酮提取率的计算[7]:玉米苞叶黄酮提取液按标准曲线绘制的操作方法测其吸光度,代入回归方程计算出样品中黄酮质量浓度C(mg/m L),则

(3)单因素试验影响玉米苞叶总黄酮提取率的因素很多,试验以料液比(1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)、乙醇质量分数(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、超声波处理时间(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min)、超声波功率(50 W、60 W、70 W、80 W、90 W、100 W)、水浴恒温时间(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min)、水浴温度(40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)6个因素为考察对象,以玉米苞叶总黄酮提取率为指标,研究各因素对玉米苞叶总黄酮提取率的影响.

(4)响应面试验根据单因素试验,选择对玉米苞叶总黄酮提取率影响明显的4个因素,根据这4个单因素试验所确定的水平范围,采用DesignGExG pert 6．0．5软件设计响应面试验.

(5)总还原力的测定试验取玉米苞叶总黄酮和维生素C分别配制成0．10 mg/m L、0．12 mg/m L、0．14 mg/m L、0．16 mg/m L、0．18 mg/m L的溶液,参考文献[8]进行试验,在700 nm处测定吸光度值.测定的吸光值越大,样品的还原能力就越强.

(6)清除DPPH自由基试验取0．10 mg/m L、0．12 mg/m L、0．14 mg/m L、0．16 mg/m L、0．18 mg/m L的玉米苞叶总黄酮溶液和维生素C溶液2 m L,参考文献[9,10],加入2 m L DPPH溶液,在517 nm处测得吸光值为A1,空白组为用2 m L 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液,测得吸光值为A2;对照组为2 m L DPPH溶液与2 m L蒸馏水在517 nm下测得吸光值为A0;以等体积蒸馏水和95%的乙醇混合液作为空白调零.DPPH自由基清除率公式为DPPH自由基清除率

(7)数据处理单因素试验、抗氧化试验的数据与作图用Graph Pad Prism 5软件处理;响应面分析与作图用DesignGExpert 6．0．5软件处理.

2　结果与分析

2．1单因素试验结果

UAE技术就是利用超声波的强振动、高加速度、强空化效应、强搅拌作用来缩短天然产物有效成分进入溶剂的时间,加快提取过程,提高提出率,并有效避免高温对有效成分的破坏[11,12].超声波处理40 min,超声波功率100 W,乙醇质量分数70%,料液比1∶25,水浴温度50℃,水浴时间35 min时,玉米苞叶总黄酮提取率最高,如图1所示.因实验室的超声波清洗器的功率最高只有100 W,所以后续试验均采用100 W的超声波来辅助提取玉米苞叶总黄酮.水浴温度对玉米苞叶总黄酮提取率的影响不是很明显,所以后续试验均采用50℃的水浴温度.

图1　各因素对玉米苞叶总黄酮提取率的影响Fig．1　Influence of each factor on the total cornGbract flavonoids extraction rate

根据单因素试验的结果,筛选出乙醇质量分数、料液比、超声波处理时间、水浴时间对玉米苞叶总黄酮提取率影响较明显,确定最佳试验范围,进行响应面试验.

2．2响应面法优化条件

(1)响应面分析方案及结果设计响应面因素水平表(见表1),选用BoxGBehnken Design模型,以玉米苞叶黄酮提取率为响应值,进行四因素三水平共29个实验点的试验,试验设计及结果见表2.

表1　响应面试验因素与水平表Table 1　Experiment factor and level list of response surface

表2　响应面试验设计和结果Table 2　Experiment design and experimental result of response surface

通过DesignGExpert 6．0．5软件对试验结果进行响应面分析,经过二次回归拟合后,得出以玉米苞叶黄酮提取率为目标函数的二次回归方程:

模型系数显著性检验和方差分析结果见表3.

表3　模型回归系数显著性检验和方差分析结果Table 3　Significance testing and variance analysis results of model regression coefficient

从表3可知,回归方程模型是极显著的,一次项B(料液比)、交互项BD(料液比与水浴时间的交互作用)对响应值的影响是显著的;二次项A2、B2、C2、D2对响应值的影响均极显著,失拟项不显著(P＝0．428 9),说明该模型的拟合度良好[13].

(2)响应面分析与优化响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图,从响应面分析图上可直观地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[14].响应面图均为向上凸起的曲面,见图2~图7.各图中随着各个因素值的增加,其响应值均出现先增大后减小,从而可获得一个优值.用DesignGExepert软件对各参数进行分析,得到超声波辅助提取玉米苞叶黄酮的最优提取条件:乙醇质量分数为79．78%,料液比为1∶25．96(g/m L),超声波处理时间40．14 min,水浴时间33．85 min.

图2　乙醇质量分数与料液比的相互作用对总黄酮提取率的影响Fig．2　The influence of interaction between ethyl alcohol content and feed solution proportion on total cornGbract flavonoids extraction rate

图3　乙醇质量分数与超声波处理时间相互作用对总黄酮提取率的影响Fig．3　The influence of interaction between ethyl alcohol content and ultrasonic treatment time on total cornGbract flavonoids extraction rate

图4　乙醇质量分数与水浴时间的相互作用对总黄酮提取率的影响Fig．4　The influence of interaction between ethyl alcohol content and waterGbath time on total cornGbract flavonoids extraction rate

图5　料液比与超声波处理时间的相互作用对总黄酮提取率的影响Fig．5　The influence of interaction between feed solution proportion and ultrasonic treatment time on total cornGbract flavonoids extraction rate

图6　料液比与水浴时间相互作用对总黄酮提取率的影响Fig．6　The influence of interaction between feed solution proportion and waterGbath time on total cornGbract flavonoids extraction rate

图7　超声波处理时间与水浴时间相互作用对总黄酮提取率的影响Fig．7　The influence of interaction between ultrasonic treatment time and waterGbath time on total cornGbract flavonoids extraction rate

为了验证响应面法能否真实地反映各因素对玉米苞叶总黄酮提取率的影响,我们用获得的最优提取条件进行了验证试验,并将最佳条件改为乙醇质量分数80%,料液比1∶26(g/m L),超声波处理时间40 min,水浴时间34 min以便于操作,得到玉米苞叶总黄酮平均提取率为0．42%,与理论预测值相差0．02%,说明响应面法是可靠的.

2．3抗氧化性结果与分析

(1)玉米苞叶总黄酮总还原力玉米苞叶总黄酮和维生素C的还原力均随着质量浓度的增大而增强.同一浓度下,玉米苞叶总黄酮的还原力比维生素C强,见图8(a).还原性越强,抗氧化性也越强[15].

(2)玉米苞叶总黄酮清除DPPH自由基玉米苞叶总黄酮和维生素C对DPPH自由基的清除作用随着质量浓度的增加越来越大.当质量浓度为0．18 mg/m L时,玉米苞叶总黄酮对DPPH自由基的清除率达82%,比维生素C强10%,见图8(b).

图8　玉米苞叶总黄酮与维生素C还原力及DPPH自由基清除率的比较Fig．8　Comparison of total cornGbract flavonoids with reducing power of VitC&scavenging activity of DPPH

3　结论

对超声波辅助提取玉米苞叶总黄酮最优工艺进行探究,在预实验中确定超声波功率为100 W,水浴温度为50℃,筛选出乙醇质量分数、料液比、超声波处理时间、水浴时间对玉米苞叶总黄酮提取的影响比较大,根据四因素三水平的响应面分析法得到了最优的工艺条件为乙醇体积分数80%,料液比1∶26(g/m L),超声波处理时间40 min,水浴时间34 min时总黄酮提取率为0．42%.玉米苞叶总黄酮提取率不高的可能原因一是超声波功率较低,未能很好地达到超声波处理的目的,二是玉米苞叶的品种所致.

体外抗氧化性的实验表明:玉米苞叶黄酮的总还原力高于维生素C,随着质量浓度的增大而增强;对DPPH自由基的清除随着质量浓度的增大而增强,同一浓度下的清除率高于维生素C.所以玉米苞叶黄酮是一种较好的天然抗氧化剂.

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Measurement on Response Surface Optimization and Antioxidation of UltrasoundGassisted Extraction of Total CornGbract Flavonoids

Deng Hongmei,Ye Yanna
(Technology Development Center of Fruit and Vegetable Processing and Storage Engineering, Guangdong University of Petrochemical Technology,Maoming 525000,China)

The influence of four factors,which includes feed solution proportion,ethyl alcohol content,ulG trasonic treatment time and waterGbath time,on the flavonoid extraction rate is designed and studied by uG sing response surface methodology optimizing the conditions of ultrasound assistance in extracting total cornGbract flavonoids from ethyl alcohol．The result shows that optimal technological condition of extracG tion of cornGbract flavonoids is as per blow:ethyl alcohol content is 80%,feed solution proportion is 1 to 26,ultrasonic treatment time is 40 minutes,and waterGbath time is 34 minutes．Result after further measG urement on the antioxidation of total cornGbract flavonoids indicates that the scavenging activity and reducG ing power of total cornGbract flavonoids on DPPH free radical is bigger than vitamin C．

Ultrasonic wave;Corn bract;Flavonoids;Antioxidation

S122

A

1004G0366(2016)02G0038G06

2015G08G17;

2015G09G29．

广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心开放基金(2015B003)．

邓红梅(1965G),女,广东茂名人,副教授,研究方向为天然产物提取及农产品加工技术．EGmail:dhm005＠126．com．