葛　敏，单　锋，2，唐　碧，侯秀杰

(1.蚌埠医学院 药学系，安徽 蚌埠 233030；2.合肥市第四人民医院 药剂科，安徽 合肥 230022；3.蚌埠医学院第一附属医院 心血管科，安徽 蚌埠 233004；4.阜阳市第一人民医院心血管科，安徽 阜阳 236000)



二十二碳六烯酸对心房颤动大鼠心房肌生理改变及双孔钾通道TASK-1蛋白表达的影响*

葛敏1，单锋1，2，唐碧3△，侯秀杰4

(1.蚌埠医学院 药学系，安徽 蚌埠 233030；2.合肥市第四人民医院 药剂科，安徽 合肥 230022；3.蚌埠医学院第一附属医院 心血管科，安徽 蚌埠 233004；4.阜阳市第一人民医院心血管科，安徽 阜阳 236000)

目的：探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠心房颤动(AF)模型心房肌生理特性的影响及相关机制研究。方法：80只乙酰胆碱-氯化钙混合液敏感的SD大鼠分为对照组(CTL组)、DHA处理组(DHA组)、房颤组(AF组)和房颤+DHA处理组(DHA+AF组)，观察房颤持续时间；采用全细胞膜片钳技术记录大鼠心房肌细胞动作电位时程(APD)和双孔钾通道TASK-1电流，Western blot测定大鼠心房组织TASK-1蛋白表达。结果：大鼠尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液后，房颤持续时间随实验天数增加而逐渐延长，DHA干预缩短房颤持续时间。与CTL组相比，AF组大鼠心房肌细胞复极50%时的动作电位时程(APD50)和复极90%时的动作电位时程(APD90)明显缩短，心房肌细胞TASK-1电流密度升高，蛋白表达升高(P<0.05)。与AF组相比，DHA+AF组大鼠心房肌细胞APD50和APD90明显延长，TASK-1电流密度和蛋白表达降低(P<0.05)。结论：DHA具有延长房颤大鼠心房肌细胞APD的作用，可能与其下调心房肌TASK-1蛋白的表达从而降低心房肌细胞TASK-1电流密度有关。

心房颤动；二十二碳六烯酸；心房电重构；TASK-1；大鼠

心房颤动(atrial fibrillation，AF)简称房颤，是指规则有序的心房电活动丧失，代之以快速无序的颤动波，是临床上最常见的心律失常之一，预计未来二三十年内房颤患者数量将增至2～3倍[1]。房颤时，心房电重构可引起空间不均一性增高以及心房内折返波长缩短，导致房颤的发作频率增加、持续时间延长，使得房颤更容易导致房颤，即“房颤致房颤”，为房颤的发生和发展提供了病理生理基础。跨膜离子通道电流的改变是引起心房电重构的基础。TASK-1通道(TWIK-related acid-sensitive K+channels-1)是近年来新发现的一种双孔钾通道，在决定动作电位时程(action potential duration，APD)上起到重要的作用[2-4]。新近研究提示TASK-1可能在房颤时发生了重构，并参与了心房电重构[5]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一种ω-3类长链多不饱和脂肪酸，是鱼油萃取物的主要成分。ω-3类长链多不饱和脂肪酸可以延长心房有效不应期，对心房电重构具有改善作用[6]。本实验室前期研究发现，DHA可以调控人肺血管平滑肌细胞上的TASK-1，其对心房肌细胞上的TASK-1是否具有调控作用尚不清楚。本实验拟观察DHA对房颤大鼠心房肌生理指标的影响，并探讨该作用是否与其对TASK-1的调控有关。

1　材料与方法

1.1实验动物与试剂

雄性SD大鼠，体质量250～300 g，购自中国人民解放军南京军区医学动物实验中心(合格证号：SCXK(军)2007-012)；多克隆山羊抗TASK-1抗体购自Santa Cruz公司；兔抗山羊IgG多克隆二抗购自武汉博士德公司；氯化乙酰胆碱、二十二碳六烯酸(DHA)、I型胶原酶、XXIV蛋白酶、EGTA、K2ATP、Na2GTP、4-aminopyridine、glibenclamide、nifedipine、E-4031、HMR1556及HEPES购自sigma公司；其余试剂为国产分析纯级的试剂。

1.2大鼠房颤模型的制备与分组

1.2.1大鼠房颤模型制备取健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，参照文献[7]，筛选出对66 μg/ml乙酰胆碱-50 mg/ml氯化钙混合液敏感的大鼠80只。造模大鼠尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液，每天给药1次，连续3 d，分析实验1～3 d所得心电图，以大鼠每天尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液后可诱发出典型房颤心电图确定为大鼠房颤模型制备成功。

1.2.2分组给药将筛选出的大鼠分为对照组(CTL组)、DHA处理组(DHA组)、房颤组(AF组)和房颤DHA处理组(DHA+AF组)，每组20只。制备大鼠房颤模型后，实验第4天开始分组给药，CTL组给予生理盐水，DHA组给予10 mg/ml DHA溶液，AF组大鼠给予生理盐水，1 h后再给予66 μg/ml乙酰胆碱-50 mg/ml氯化钙混合液；DHA+AF组大鼠首先静脉注射生理盐水，1 h后给予66 μg/ml乙酰胆碱-50 mg/ml氯化钙混合液，然后给予10 mg/ml DHA溶液，每天给药1次，连续14 d。

1.3房颤持续时间测定

实验第3、4、10、17天，记录大鼠尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液前后标准Ⅱ导联心电图，以给药后心电图显示P波消失、出现f波的典型房颤心电图作为房颤发生标志，以恢复窦性心律、P波出现、f波消失作为房颤终止标志，房颤发生至终止所持续的时间即为房颤持续时间。

1.4心房肌细胞动作电位时程(APD)与TASK-1电流测定

1.4.1分离心房肌细胞房颤持续时间测定结束后，每组取3只大鼠，剪取大鼠右心房组织，置于4℃左右氧饱和的无钙台氏液(137 mmol/L NaCl，11.9 mmol/L NaHCO3，5.4 mmol/L KCl，0.53 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，5 mmol/L HEPES，10 mmol/L牛磺酸，10 mmol/L葡萄糖)中洗净血液，剪取约0.3 cm3大小的组织块，置于氧饱和的EGTA液中清洗脱钙2遍。将组织块置于含有酶液A(1.5 mg/ml I型胶原酶，1 mg/ml XXIV蛋白酶，1 mg/ml BSA，加至无钙台氏液中)的试管中消化，37℃水浴30 min，通入100%的氧气。消化完毕后，将组织块置于含有1 ml酶液B(1.5 mg/ml I型胶原酶，加至无钙台氏液中)的试管中，37℃水浴5 min，通入100%的氧气。消化完毕后，收集酶解液，800 r/min离心5 min，收集细胞，将细胞保存在KB液(70 mmol/L KOH，40 mmol/L KCl，20 mmol/L KH2PO4，3 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES，50 mmol/L谷氨酸，20 mmol/L牛磺酸，10 mmol/L葡萄糖)中约1 h后即可用于膜片钳实验。

1.4.2全细胞膜片钳记录大鼠心房肌细胞APD与TASK-1电流(1)选取细胞：将分离好的细胞悬液滴于倒置显微镜上方的浴槽内，待细胞贴壁良好后，选择静止、杆状、横纹清晰的心房肌细胞进行后续实验(每只大鼠取8个心房肌细胞)。(2)微电极的制备及高阻抗封接形成：利用微电极拉制器经两步法拉制出尖端直径约为1 μm的玻璃微电极，电极阻抗约为3～5 ΜΩ。由尖端吸入电极内液(60 mmol/L KCl，65 mmol/L glutamate，5 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，3 mmol/L K2ATP，0.2 mmol/L Na2GTP，5 mmol/L HEPES)，再用注射器反向冲灌，将微电极经微电极夹持器的侧管与注射器相连。用注射器向微电极加正压，调节操纵器将微电极缓缓浸入浴液，直至接触心房肌细胞，去掉正压再用注射器抽吸形成10～20 cm H2O的负压，当封接电阻达到10 GΩ以上时，继续施加负压，用力吸破电极尖端的细胞，形成全细胞记录。(3)心房肌细胞APD的记录：应用电流钳方法，用Axon-200B刺激器输出方波(波宽2 ms，频率1 Hz，1.5倍阈强度电压)驱动标本，引发心肌细胞动作电位，记录并分析心房肌细胞APD50和APD90。(4)心房肌细胞TASK-1电流的记录：电压钳制在-30 mV，然后去极化至+40 mV，时间为5 s(目的是失活一过性外向电流)，同时为了消除其它电流的影响，细胞灌流液(135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.33 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L葡萄糖)中加入相应通道的阻断剂(Ito:2 mmol/L 4-aminopyridine；IKATP:2 mmol/L glibenclamide；ICa:10 mmol/L nifedipine；IKr:1 mmol/L E-4031；IKs:2 mmol/L HMR1556)，接着给予从+40 mV 至-90 mV斜波刺激(-15 mV/s)，斜波刺激结束后钳制电位在-30 mV。不同实验组电流的比较采用电流密度，以消除细胞间因面积不同造成的电流误差。注：电流密度为电流强度与膜电容的比值(pA/pF)。

1.5免疫印迹法(Western blot)检测TASK-1蛋白表达

实验第18天，房颤持续时间测定结束后，每组抽取3只大鼠，取心房组织，取50～100 mg心房组织提取总蛋白，BCA法蛋白定量后进行SDS- PAGE电泳分离蛋白，蛋白转印到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液4℃封闭过夜。TASK-1一抗在37℃孵育30 min后4℃孵育过夜，将PVDF膜置入二抗工作液中室温孵育2 h，ECL显色曝光。采用Bio-Rad quantity one对半定量分析目的条带的积分光密度值，相对蛋白含量用积分光密度值表示。

1.6统计学处理

2　结果

2.1DHA对大鼠房颤持续时间的影响

分析第3、4、10、17天大鼠尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液前后的心电图。结果显示，随实验天数的增加，AF组与DHA+AF组大鼠的房颤持续时间逐渐延长；实验第10、17天，与AF组相比，DHA+AF组大鼠房颤持续时间明显缩短(P<0.05)，提示DHA可以缩短房颤持续时间(表1)。CTL组和DHA组大鼠未出现房颤。

DayAF DHA+AF D37.4±2.78.0±2.1D49.9±3.610.6±3.2D1029.8±4.2*18.7±4.3*△D1737.3±5.6#20.7±4.9#△

AF:Atrial fibrillation;DHA:Docosahexaenoic acid

*P<0.05 vs D4 group;#P<0.05 vs D10 group;△P<0.05 vs AF group

2.2DHA对大鼠心房肌细胞APD和TASK-1电流的影响

AF组大鼠心房肌细胞APD50为(0.83±0.09)，APD90为(0.81±0.09)，与CTL组相比明显缩短，DHA组APD50和APD90分别为(1.25±0.14)和(1.23±0.14)，与DHA+AF组APD50(1.10±0.09)和APD90(1.11±0.10)相比明显延长(P<0.05)；与AF组相比，DHA+AF组大鼠心房肌细胞APD50和APD90明显延长(P<0.05，表2)。AF组和DHA+AF组大鼠心房肌细胞TASK-1电流密度分别为(2.36±0.17)和(1.90±0.12)，与CTL组大鼠心房肌细胞TASK-1电流密度(1.65±0.14)相比明显升高(P<0.05)，DHA组TASK-1电流密度为(1.26±0.11)，与CTL相比明显降低(P<0.05)；与AF组相比，DHA+AF组大鼠心房肌细胞TASK-1电流密度明显降低(P<0.05，图1)。

GroupAPD50APD90CTL1.0±01.0±0AF0.83±0.09*0.81±0.09*DHA1.25±0.14*1.23±0.14*DHA+AF1.10±0.09*#1.11±0.10*#

APD50:Time of atrial myocyte action potential duration at 50% repolarization;CTL:Control

*P<0.05 vs CTL group；#P<0.05 vs AF group

*P<0.05 vs CTL group；#P<0.05 vs AF group

2.3DHA对大鼠心房组织TASK-1蛋白表达的影响

CTL组大鼠心房组织TASK-1蛋白与内参GAPDH比值为(0.39±0.06)。AF组TASK-1蛋白与内参GAPDH比值为(0.63±0.07)，DHA+AF组大鼠心房组织TASK-1蛋白与内参GAPDH比值为(0.50±0.05)，与CTL组相比表达均明显升高，DHA组TASK-1蛋白与内参GAPDH比值为(0.28±0.05)，与CTL组相比有所降低(P<0.05)；与AF组相比，DHA+AF组大鼠心房组织TASK-1 蛋白表达明显降低(P<0.05，图2)。

A:The protein expressions of TASK-1 and GAPDH；B:The ratio of TASK-1/GAPDH

*P<0.05 vs CTL group；#P<0.05 vs AF group

3　讨论

房颤作为临床上最常见的心律失常之一，对患者可造成严重危害，导致心力衰竭等致残致死性并发症，严重影响患者的生活质量和生命健康[8]。由于房颤的发病机制十分复杂且容易复发，使得房颤的长期治疗效果并不理想。心房肌生理特性的改变在房颤的发生发展过程中起到重要作用，改善或逆转房颤时的心房肌生理特性，能够有效地抑制房颤的发生发展，目前已成为治疗房颤的研究热点。

有研究表明，在狗的房颤模型中ω-3 PUFAs可以改善心房电重构[6]，但这种作用来自于哪种成分并不清楚。本实验结果显示，房颤大鼠心房肌细胞的APD50和APD90明显缩短，DHA明显延长房颤大鼠的APD50和APD90，提示DHA具有改善房颤大鼠心房肌生理特性的作用。

大鼠心肌细胞动作电位离子机制与人相似，钙离子、钾离子通道电流是心房肌细胞动作电位复极化过程中的主要离子通道电流[9]。这两种跨膜离子流发生变化，引起心房肌细胞APD缩短，易诱导房颤的发生[10]，调控钙离子和钾离子通道电流已成为抑制房颤时心房电重构的重要环节。双孔钾通道是上世纪90年代发现的一类钾离子通道，能产生瞬时性和非失活性的电流，在所有膜电位时程中均有活性。TASK-1通道是双孔钾通道的重要一员，对细胞外的pH值敏感，对常用的钾通道阻断剂不敏感。TASK-1在心肌细胞上高表达，主要参与调节细胞膜的背景钾电流和动作电位时程、控制细胞静息膜电位[2]。Limberg等[3]的研究发现，ITASK-1约占人心房肌细胞背景电流的40%左右，心房肌细胞TASK-1的表达上调后心房肌细胞APD缩短；Putzke等[4]发现使用TASK-1阻滞剂A293后可延长大鼠心室肌细胞的APD；Donner等[11]也发现TASK-1基因敲除小鼠的心肌细胞APD显著延长，Barth等[5]观察到房颤患者的心房组织中TASK-1 mRNA表达水平升高，提示TASK-1可能在房颤时发生基因转录及蛋白表达水平的改变，从而引起通道电流的变化。本实验室前期研究结果表明，DHA可以调控人肺血管平滑肌细胞上的TASK-1，故我们推测DHA可能通过调控心房肌细胞上的TASK-1而延长房颤大鼠心房肌细胞的APD。结果显示，房颤大鼠心房肌细胞APD50和APD90缩短的同时TASK-1电流密度及蛋白表达升高，提示房颤时心房肌细胞APD的缩短可能与TASK-1蛋白表达增高从而引起电流密度的升高有关；DHA延长房颤大鼠心房肌细胞APD50和APD90，降低心房肌细胞TASK-1电流和蛋白表达，提示DHA延长房颤大鼠心房肌细胞APD的作用可能通过下调心房肌细胞TASK-1蛋白表达进而降低TASK-1的电流密度有关。值得注意的是，房颤时心房肌细胞APD的缩短是众多离子通道电流变化引起的结果，DHA还可能通过参与调控其他离子通道电流来延长心房肌细胞APD改善房颤，具体机制还有待于进一步研究。

总之，本研究表明，DHA能够缩短房颤大鼠的房颤持续时间，延长APD，其机制可能与其下调房颤时心房肌细胞TASK-1的蛋白表达进而抑制TASK-1电流有关。本研究结果可为DHA治疗房颤提供进一步的实验依据。

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Effects of docosahexaenoic acid on atrial physiological parameter and TASK-1 protein expression in atrial fibrillation rats

GE Min1,SHAN Feng1，2,TANG Bi3△,HOU Xiu-Jie4

(1.Department of Pharmacy,Bengbu Medical College,Bengbu 233004;2.Department of Pharmacy,the Fourth People's Hospital of Hefei,Hefei 230022;3.Department of Cardiovascular Medcine,the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233004; 4.Department of Cardiovascular Medcine,the First People's Hospital of Fuyang,Fuyang 236000,China)

Objective:To investigate the effect of docosahexaenoic acid(DHA)on atrial physiological parameter and its related mechanisms in atrial fibrillation rats.Methods:Eighty Sprague-Dawley(SD)rats which were sensitive to acetylcholine-calcium chloride mixture were randomly divided into four groups:control(CTL),control treated with DHA(DHA),atrial fibrillation(AF)and atrial fibrillation treated with DHA(DHA+AF).The duration of atrial fibrillation was measured.The atrial myocyte action potential duration(APD)and TWIK-related acid-sensitive K+channels-1(TASK-1)currents were recorded by whole-cell patch-clamp technique.The expression of TASK-1 at protein level in atrial tissue was detected by Western blot method.Results:Atrial fibrillation of the rats was induced by acetylcholine-calcium chloride mixture,and the duration time of atrial fibrillation was increased with the drug-induced time prolonged.Compared with control group,the time of atrial myocyte action potential duration at 50% repolarization(APD50)and at 90% repolarization(APD90)were significantly shorten in AF group,TASK-1 current density and TASK-1 protein expression were increased(P<0.05).Compared with AF group,the duration of atrial fibrillation was decreased，the time of atrial myocyte APD50and APD90were prolonged,TASK-1 current density and protein expression were significantly reduced in DHA+AF group(P<0.05).Conclusion:DHA can prolong the atrial myocyte APD in atrial fibrillation rats,which may be related to down-regulation of TASK-1 protein expression and decreasing TASK-1 current density in atrial tissue.

atrial fibrillation;docosahexaenoic acid;atrial electrical remodeling;TASK-1

国家自然科学基金资助项目(81170046)；教育部留学回国人员科研启动基金(第46批)；安徽省自然科学基金资助项目(10040606Q44)

2015-05-11

2015-11-27

△Tel:15855798487；E-mail:bitang2000@163.com

R541.75

A

1000-6834(2016)02-128-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.009