李　蕾

(淮北师范大学体育学院，安徽 淮北 235000)



运动对高脂饲料喂养大鼠骨骼肌和肝脏组织脂联素-脂联素受体-腺苷酸活化蛋白激酶通路的影响*

李蕾△

(淮北师范大学体育学院，安徽 淮北 235000)

目的：探讨运动影响高脂喂养大鼠骨骼肌和肝脏组织在腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路上的可能机制。方法：40只雄性SD大鼠随机分为4组(n=10)：正常对照组(C组)：正常饮食不运动；正常饮食运动组(E组)：正常饮食同时进行10周游泳运动；高脂饮食对照组(H组)：高脂饲料喂养不运动；高脂饮食运动组(HE组)：高脂饲料喂养同时进行10周游泳运动。采用实时荧光定量PCR检测大鼠骨骼肌和肝脏脂联系受体1(AdipoR1)，AdipoR2 mRNA表达，Western blot检测大鼠骨骼肌和肝脏腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)蛋白表达及磷酸化水平。结果：股四头肌AdipoR1 mRNA、肝脏AdipoR2 mRNA表达在H组显著低于C组(P<0.05)；HE组股四头肌和肝脏AMPKα(Thr172)磷酸化水平显著高于H组(P<0.05)，分别较H组高43.2%和51.1%。结论：高脂喂养导致大鼠骨骼肌和肝脏AdipoR1/R2 mRNA表达下调，运动提高了大鼠骨骼肌和肝脏AMPKα(Thr172)磷酸化水平。

大鼠；脂联素；运动干预；脂联素受体1/2；AMPK

脂联素(adiponectin)是迄今为止发现的唯一一种在脂肪容积增大时分泌减少的蛋白[1]。其在肥胖、2型糖尿病(T2DM)患者及存在胰岛素抵抗但未发生T2DM的一级亲属体内下降，提高脂联素水平可提高胰岛素敏感性[2]。脂联素受体(AdipoR)的克隆为研究脂联素各种功能及作用机制提供了新的线索。在脂联素受体介导的多条信号转导通路研究进展中发现，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是其中的关键。因此，Adiponectin-AdipoR-AMPK通路成为脂联素发挥生物学作用的重要信号通路。有关运动和膳食因素对不同组织脂联素受体影响的研究较少，且结论不一[3]。本研究通过观察运动对高脂饲料喂养大鼠不同组织(骨骼肌和肝脏)Adipo RmRNA以及AMPKα蛋白表达及磷酸化水平的影响，以探讨运动影响高脂喂养大鼠骨骼肌和肝脏组织在AMPK通路上的可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及运动干预

40只SPF级SD纯系6周龄雄性大鼠，体重170～200 g。随机分为4组(n=10)：对照组(C组)、正常饮食运动组(E组)、高脂饮食对照组(H组)、高脂饮食运动组(HE组)。适应性喂养后，C组和E组维持正常饮食，H组和HE组改高脂饮食，E组和HE组同时开始无负重游泳训练。高脂饲料配方为基础饲料基础上增加15%猪油和2%的大豆粉，热卡百分比为蛋白质占23.5%，脂肪44.1%，碳水化合物32.4%，提供能量约408 kcal/100 g。训练方案参照Ploug 方法[4]。运动持续时间从30 min/d逐渐过渡至90 min/d直至实验末，每周5 d，共持续10周。

1.2方法

1.2.1取材待E组和HE组末次运动结束48 h，全部大鼠禁食12 h，以2%戊巴比妥钠40 mg/kg体重腹腔内麻醉，大鼠仰卧固定，取肝脏和双侧股四头肌。EP管分装，投液氮，-80℃冻存备用。

1.2.2大鼠骨骼肌AdipoR1 mRNA和肝脏AdipoR2 mRNA实时荧光定量PCR检测取0.5 g肝脏组织，低温粉碎，制备组织匀浆，离心取上清液分装，-80℃冰箱冻存备上样。采用SDS-PAGE电泳，灌胶，上样，电泳，之后尽快使用Bio-Rad蛋白转移装置转膜。将膜转移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。将一抗(兔抗大鼠AMPKα单克隆抗体和兔抗大鼠AMPKαThr172磷酸化单克隆抗体)用TBST稀释液稀释(1∶2 000)，封闭液中取出膜，膜蛋白面朝下置于抗体液面上，37℃孵育1 h后4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。培养皿内加入10 ml二抗稀释液TBST(1∶3 000)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，摇床上室温孵育1～2 h，TBST洗涤3次后，进行化学发光反应。X光胶片曝光，显影，定影，自来水冲洗，室温下晾干。扫描胶片保存，使用凝胶图象处理系统(Totallab V2.01)进行分析。磷酸化程度以磷酸化AMPKα的条带灰度与总AMPKα条带灰度的比值来计算。

1.3统计学处理

2　结果

2.1大鼠骨骼肌AdipoR1、肝脏AdipoR2 mRNA表达的实时荧光定量PCR结果

大鼠骨骼肌AdipoR1 mRNA、肝脏AdipoR2 mRNA表达在H组显著低于C组(P<0.05，表1)，其余组别无显著性差异。

GroupAdipoR1mRNA(Skeletalmuscle)AdipoR2mRNA(Liver)C3.71±0.203.8±0.38E3.42±0.173.5±0.19H3.01±0.16*2.81±0.13*HE2.78±0.122.91±0.10

C：Control group；E：Normal dietary exercise group；H：High fat dietary control group；HE：High fat dietary exercise group；AdipoR：Adiponectin receptor

*P<0.05 vs C group

2.2大鼠骨骼肌AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测结果

四组大鼠骨骼肌之间AMPKα蛋白表达没有显著性差异。HE组AMPKα(Thr172)磷酸化水平显著高于H组(P<0.05)，较H组高43.2%；E组AMPKα(Thr172)磷酸化水平非常显著性高于C组(P<0.01)，较C组高83.7%(图1，表2)。

Fig.1Testing results of AMPKα protein expression and phosphorylation in rats skeletal muscle

GroupSkeletalmuscleLiver C0.32±0.030.42±0.04E1.97±0.10**0.53±0.04H0.47±0.030.38±0.02HE0.83±0.06#0.79±0.05#

C：Control group；E：Normal dietary exercise group；H：High fat dietary control group；HE：High fat dietary exercise group；AdipoR：Adiponectin receptor

**P<0.01 vs group C;#P<0.05 vs group H

2.3大鼠肝脏AMPKα蛋白表达及磷酸化水平检测结果

四组大鼠肝脏组织之间AMPKα蛋白表达没有显著性差异。AMPKα(Thr172)磷酸化水平在HE组和H组间有显著性差异，HE组显著高于H组(P<0.05)，较H组高51.1%(图2，表2)。

Fig.2Testing results of AMPKα protein expression and phosphorylation in rats liver

3　讨论

脂联素(adiponectin)主要由脂肪组织分泌，与体脂含量负相关，通过与脂联素受体结合，发挥其抗炎、抗动脉粥样硬化和胰岛素增敏等作用。其分子量约30 kD，也被称为脂肪补体相关蛋白30 kD(adipocyte complement-related protein of 30 kD,Acrp30)。研究表明，在调解糖、脂代谢中发挥更强生物学作用的并非含有244个氨基酸残基的多肽-全长脂联素，而是全长脂联素经过白细胞弹性蛋白酶裂解后产生的球形脂联素。

脂联素受体目前发现有3种，分别是2003年Yamauchi等发现的AdipoR1和AdipoR2，以及后续发现的T钙黏素，但介导脂联素生物学功能的受体主要是AdipoR1和AdipoR2。脂联素受体在脂肪组织表达与脂肪分布、胰岛素抵抗有关；在骨骼肌表达与血糖血脂代谢有关；在肝脏表达与胰岛素敏感性有关。脂联素受体在各器官组织分布的差异提示其存在不同的调节机制[5-7]。本实验未发现运动对骨骼肌和肝脏AdipoR1/R2 mRNA水平产生显著性影响。查阅文献，运动影响AdipoR的研究结果存在不确定结论。本实验可能与运动干预持续时间有关；也有可能在运动过程中诱导出某些抑制修正效应；或者与运动条件下脂肪细胞因子间可能的交互作用(如瘦素和脂联素)有关[5]。

脂联素的活性形式通常有全长型结构域(fAcrp30)和球型结构域(gAcrp30)两种。前者几乎全部存在于血浆中，主要在抑制肝脏糖异生和葡萄糖释放中起作用；后者被认为是实现脂联素生物学效应的主要区域。Tomas E等[8]用2.5 μg/ml的gAcrp30对趾长伸肌进行预处理，以及给C57BL/6J小鼠在体注射gAcrp30两个实验，均发现了AMPK磷酸化增强、乙酰辅酶A脱羧酶磷酸化和丙二酰辅酶浓度受到抑制的现象，提示gAcrp30与AICAR和运动有相似的促进糖脂代谢的作用，并且这种作用与AMPK激活有关。本实验中，运动显著提高大鼠股四头肌AMPKα(Thr172)磷酸化水平，提示运动持续激活并提高了高脂喂养大鼠股四头肌AMPKα的活性。实验结果吻合Sriwijitkamol A等的研究[9,10]。可能主要调节了ACC、MCA脱羧酶(MCD)、激素敏感性脂肪酶(HSL)等。结合前期对AdipoR1/2在骨骼肌和肝脏分布的实验[5]，提示运动可能激活了高脂喂养大鼠骨骼肌gAcrp30-AdipoR1-AMPK通路。本实验中，运动显著提高大鼠肝脏AMPKα活性，提示运动持续激活并提高了高脂喂养大鼠肝脏AMPKα的活性。由于全长的脂联素受体主要在肝脏表达并激活肝脏AMPK，因此推测运动可能激活了高脂喂养大鼠肝脏Acrp30-AdipoR2-AMPK通路。

[1]Ouchi N,Kihara S,Arita Y,et al.Novel Modulator for Endothelial Adhesion Molecules:Adipocyte-derived Plasma Protein Adiponectin[J].Circulation JT,1999,100(25):2473-2476.

[2]蔡景英，柳亢宗，朱丽华.2型糖尿病血清脂联素水平与糖脂代谢异常的相关性研究[J].中国现代医学杂志,2004,14(12):108-113.

[3]Jurimae J,Purge P,Jurimae T.Adiponectin is altered after maximal exercise in highly trained male rowers[J].Eur J Appl Physiol JT,2005,93(4):502-505.

[4]Ploug T,Stallknecht BN,Pedersen D,et al.Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle[J].Am J Physiol,1990,259(6Pt1):E778-786.

[5]李蕾,李之俊.大鼠胰岛素抵抗形成中脂联素受体基因表达及运动的影响[J].中国应用生理学杂志，2012,28(5)：465-466.

[6]Bullen JW Jr,Bluher S,Kelesidis T,et al.Regulation of adiponectin and its receptor in response to development of diet-induced obesity in mice[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,292(4):E1079-1086.

[7]李春霖，龚燕平，田慧，等.吡格列酮对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠脂肪组织脂联素机器受体表达的影响[J].中国新药杂志，2006,15(6):429-432.

[8]Tomas E,Tsao TS,Saha AK,et al.Enhanced muscle fat oxidation and glucose transport by ACRP30 globular domain:acetyl-CoA carboxylase inhibition and AMP-activated protein kinase activation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(25):16309-16313.

[9]Sriwijitkamol A，Coletta DK，Wajcberg E，et al.Effects of acute exercise on AMPK signaling in skeletal muscle of subjects with type 2 diabetes:A time-course and dose-response study[J].Diabetes,2007,56(3):836-848.

[10]Nicolas M,Fujii N,Hirshman MF,et al.AMP-Activated Protein Kinase(AMPK)is activated in muscle of subjects with type 2 diabetes during exercise[J].Diabetes,2001,50(5):921-927.

rat;adiponectin;exercise intervention;adiponectin R1/R2；AMPK

安徽高校优秀青年人才基金重点项目(2013SQRL032ZD)；淮北市科技人才培育计划(20140304)

2015-02-10

2015-10-10

△Tel：13909615572；E-mail：lisulei73@aliyun.com

G804.4;R285.5

A

1000-6834(2016)02-109-03

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.004