马奎影，万　全，王伊林，陶谢鑫，黄　侠，柴　花，赵　明

(内蒙古民族大学附属医院，通辽 028000)



黄芪注射液对网腔钙结合蛋白基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78，GRP94 mRNA的作用*

马奎影，万全，王伊林，陶谢鑫，黄侠，柴花，赵明△

(内蒙古民族大学附属医院，通辽 028000)

目的：研究黄芪注射液对网腔钙结合蛋白(calumenin)基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78，GRP94 mRNA的作用。方法：实验将体外培养的1～3 d乳鼠心肌细胞分为5组：对照组、模型组(正常细胞+3 mg/L阿霉素)、calumenin基因沉默模型组(慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素)、黄芪组1(正常细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪)、黄芪组2(慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪)。构建慢病毒-calumenin质粒，转染乳鼠培养心肌细胞,采用实时荧光定量分析(real-time PCR)检测各组心肌细胞calumenin及内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达。结果：①与对照组比较，模型组心肌细胞calumenin mRNA表达减少(P<0.05)，而calumenin基因沉默模型组及黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显减少(P<0.01)；与模型组比较，黄芪组1心肌细胞calumenin mRNA表达增加(P<0.05)；与calumenin基因沉默模型组比较，黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显增加(P<0.01)。②与对照组相比较，模型组及calumenin基因沉默模型组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达明显增多(P<0.01)；与模型组比较，黄芪组1心肌细胞GRP78、GRP94 mRNA表达明显减少(P<0.01)；与calumenin基因沉默模型组比较，黄芪组2心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达明显减少(P<0.01)。结论：①阿霉素损伤可引起心肌细胞calumenin表达减少。②Calumenin可缓解阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激。黄芪注射液可抑制阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激，这种作用可能系通过calumenin介导实现的。

阿霉素；黄芪；网腔钙结合蛋白；内质网应激;心肌细胞;乳鼠

阿霉素属蒽环类抗癌药物，具有抗瘤谱广、抗瘤活性强的特点，临床上广泛应用于多种恶性肿瘤治疗。但因对心肌的毒性作用，限制了其在抗肿瘤中的临床应用。随其剂量的增加而导致不可逆的心肌损伤，最终可发生扩张性心肌病及充血性心力衰竭[1]。关于阿霉素心肌损伤的发病机制目前尚不清楚，主要有以下观点：(1)自由基损伤；(2)线粒体损伤；(3)钙超载；(4)细胞凋亡[2]。凋亡的产生机制复杂,近年发现内质网应激反应介导的细胞凋亡是一条新的细胞凋亡信号转导通路[3]。网腔钙结合蛋白(calumenin)是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand 结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白[4]，与Ryanodine(雷诺定)受体(RyR2)通道及Ca2+-ATPase(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)相互作用调节心肌细胞钙释放，钙回摄与储存，共同维持钙循环稳态[5]。中药黄芪具有显著的益气强心作用，文献报道黄芪及其有效作用成分对阿霉素损伤心肌细胞有保护作用[6,7],但作用机制尚未完全阐明。目前关于黄芪注射液对calumenin及内质网应激介导凋亡研究还未见报道。本研究拟应用质粒介导shRNA实验技术研究黄芪注射液对calumenin基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激的作用，为阿霉素心肌损伤发病机制及其临床应用提供依据。

1　材料与方法

1.1动物、药品与仪器

1～3 d SD乳鼠购自吉林大学基础医学院动物中心,许可证号：scxk(吉)2011-0004;shRNA慢病毒-calumenin质粒购于沈阳万类生物科技有限公司，干扰片段信息：calumenin -sh1 ggatggagacctaattgcc；NC ttctccgaacgtgtcacgt；Super M-MLV 反转录酶(BioTeke)公司,RNA simple Total RNA Kit试剂盒(TIANGEN)公司,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,阿霉素(深圳万东药业),黄芪注射液(上海新亚药业)。

1.2乳鼠心肌细胞的分离与培养

将乳鼠处死取心脏放入培养皿中，用PBS反复清洗后剪碎至1～3 mm3小块，加入0.1%Ⅱ型胶原酶及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min后移入15 ml离心管1 500 r/min离心7 min去上清。用PBS重悬沉淀，用吸管反复吹打后1 000 r/min离心5 min，用培养基重悬细胞，过200目筛网去除大块组织。PBS清洗细胞两次，1 000 r/min离心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培养基重悬细胞，进行细胞计数后放置到培养板中。2 h差速贴壁法去除大量的成纤维细胞，上清悬液中则为较纯的心肌细胞。细胞放置在培养板上静置24 h，随后每2 d换一次液。培养细胞至密度为90%左右，PBS清洗2次。按实验内容将细胞接种于6孔板中，置于37 ℃，5%CO2的培养箱内培养过夜。24 h后可进行转染，细胞密度一般在70%为宜。

1.3慢病毒感染分组及处理方法

(1)准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用前轻轻摇匀。(2)感染目的细胞：从培养箱中取出细胞，观察其生长状态，如细胞状态较好则开始慢病毒感染。(3)用移液器吸取准确体积(病毒数与细胞数比值为10∶1)的病毒液加入准备好的培养基中。(4)在培养基中加入ploybrene(8 μg/ml)提高病毒的感染效率。(5)吸去细胞中剩余的培养基，在待转染细胞中分别加入计算好的病毒液。(6)混匀后放于37 ℃，5%CO2的培养箱内孵育过夜。(7)24 h后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液(含有10%血清的DMEM培养基)，37℃、5%CO2继续培养，转染48 h后进行加药处理。(8)按如下分组进行加药处理：对照组(正常细胞)、模型组(正常细胞+3 mg/L阿霉素)、网腔钙结合蛋白基因沉默模型组(慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素)、黄芪组1(正常细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪)、黄芪组2(慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪)，黄芪注射液浓度参照发表文献[8]。

1.4real-time PCR检测各组心肌细胞calumenin及GRP78、GRP94 mRNA表达

引物序列见表1。经下列实验步骤：样本总RNA提取，RNA浓度检测，反转录，荧光定量PCR检测。每种样本每个基因进行4个复孔平行实验，实验数据的选取，舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据，利用2-△△CT方法分析数据。

Tab.1The primer sequence of calumenin,GRP78 and GRP94 for qPCR analysis calumenin,GRP78,GRP94 mRNA primer sequence

Genes5'-3'CalumeninFGGTGAAGACAGAGCGAGAACCalumeninRATCTCCTCCTTGGTGAGCTTGRP78-FCAGCCAACTGTAACAATCAAGRP78-RCTGTCACTCGGAGAATACCAGRP94-FGGTGTTGTGGATTCCGATGAGRP94-RAAGTTTAGCAAGCCGTGTβ-actin-FCTGTGCCCATCTACGAGGGCTATβ-actin-RTTTGATGTCACGCACGATTTCC

1.5统计学方法

2　结果

2.1各组乳鼠心肌细胞图片

各组心肌细胞经免疫荧光图片分析，网腔钙结合蛋白基因沉默模型组及黄芪组2心肌细胞慢病毒质粒转染成功(图1见彩图页Ⅱ)。

2.2real-time PCR检测各组乳鼠心肌细胞calumenin mRNA表达

与对照组比较，模型组心肌细胞calumenin mRNA表达减少(P<0.05)，而calumenin基因沉默模型组及黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显减少(P<0.01)；与模型组比较，黄芪组1心肌细胞calumenin mRNA表达增加(P<0.05)；与calumenin基因沉默模型组比较，黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显增加(P<0.01，图2,表2)。

Fig.2The melting and amplification curve of calumenin mRNA

A:Calumenin;B:Calumenin interference;

The left of A/B(the x-coordinate is temperature,the y-coordinate is dF/dT);The right of A/B(the x-coordinate is △ Rn,the y-coordinate is Cycle)

Tab.2Expression of calumenin mRNA in the mouse myocardial cells

Group2-ΔΔCtControlgroup1.25±0.04Modelgroup0.90±0.03*Calumeningenesilencingmodelgroup0.40±0.02**Astragalus1group1.20±0.03**Astragalus2group0.70±0.01**

*P<0.05,**P<0.01 vs control

2.3real-time PCR检测各组乳鼠心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78 mRNA表达

与对照组相比较，模型组及calumenin基因沉默模型组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78 mRNA表达明显增多(P<0.01)；与模型组比较，黄芪组1心肌细胞GRP78 mRNA表达明显减少(P<0.01)；与calumenin基因沉默模型组比较，黄芪组2心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78 mRNA表达明显减少(P<0.01,表3)。

Tab.3Expression of endoplasmic reticulum stress chaperone GRP78 mRNA in mouse myocardial cells

Group2-ΔΔCtControlgroup0.80±0.02Modelgroup1.70±0.04**Calumeningenesilencingmodelgroup2.30±0.02**Astragalus1group1.00±0.02**Astragalus2group1.34±0.03**

**P<0.01 vs control

2.4real-time PCR检测各组乳鼠心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP94 mRNA表达

与对照组相比较，模型组及calumenin基因沉默模型组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP94 mRNA表达明显增多(P<0.01)；与模型组比较，黄芪组1心肌细胞GRP94 mRNA表达明显减少(P<0.01)；与calumenin基因沉默模型组比较，黄芪组2心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP94 mRNA表达明显减少(P<0.01,表4)。

Tab.4Expression of endoplasmic reticulum stress chaperone GRP94 mRNA in the mouse myocardial cells

Group2-ΔΔCtControlgroup1.00±0.02Modelgroup1.70±0.04**Calumeningenesilencingmodelgroup2.40±0.03**Astragalus1group1.10±0.02**Astragalus2group1.90±0.02**

**P<0.01 vs control

3　讨论

内质网(endoplasmic reticulum，ER)在心肌等肌细胞内称肌浆网，内质网是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的细胞器。蛋白折叠是一个复杂的过程，初级多肽链转变为热动力学稳定的三级结构，继而形成有功能的结构蛋白。内质网稳态失衡时，内质网正确折叠蛋白质功能异常，可能致误折叠蛋白在内质网内异常聚集及内质网应激性蛋白分泌增加，并且识别错误折叠蛋白，并通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS发生后，内质网通过上调分子伴侣蛋白GRP78及GRP94 表达、抑制蛋白质合成、加速错误折叠和未折叠蛋白质降解等方式缓解ERS。然而持续或较严重的ERS 则触发凋亡信号，诱导CHOP、caspase-12、JNK 等促凋亡因子的表达及活化，导致细胞凋亡[9]。本研究发现内质网应激介导了阿霉素心肌病大鼠心肌细胞凋亡[10]。

网腔钙结合蛋白(calumenin)是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand 结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白，文献报道：calumenin缓解心肌细胞ERS并减少ERS介导的心肌细胞凋亡数量[11]。本课题组在前期实验中发现calumenin对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用[12]。要明确黄芪对calumenin及内质网应激介导的心肌细胞凋亡的作用，必须先沉默calumenin基因，制备阿霉素损伤心肌细胞模型，比较黄芪注射液对未沉默calumenin基因及沉默calumenin基因的阿霉素损伤心肌细胞作用，明确黄芪注射液是否通过干预calumenin表达缓解内质网应激来发挥对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用机制。

在本实验中观察到阿霉素损伤可引起心肌细胞calumenin表达减少，calumenin可缓解阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激，以及黄芪注射液可抑制阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激，并且这种作用可能系通过calumenin介导实现的。上述机制为阿霉素心肌病发病机制提供基础理论研究以及临床治疗依据。

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[5]Sahoo SK,Kim T,Kang GB,et al.Characterization of calumenin-SERCA2 interaction in mouse cardiac sarcoplasmic reticulum[J].J Biol Chem,2009,284(45):31109-31121.

[6]梁丽英,陈晶，黄小琪.黄芪注射液拮抗阿霉素诱导小鼠心肌细胞凋亡的实验研究[J].时珍国医国药,2011,22(9):2212-2213.

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[9]路晓庆，边云飞，李茂莲，等.β受体阻滞剂对乳鼠心肌细胞内质网应激致凋亡途径的影响[J].中国药物与临床,2010,10(6):641-644.

[10]宝云龙，哈申高娃，赵明，等.磷酸肌酸钠及丹参酮ⅡA磺酸钠对阿霉素心肌病大鼠内质网应激介导心肌细胞凋亡作用研究[J].中国分子心脏病学研究,2014,14(5):1085-1088.

[11]Lee JH,Kwon EJ,Kim do H.Calumenin has a role in the alleviation of ER stress in neonatal rat cardiomyocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,439(3):327-332.

[12]赵雅君，王伊林，赵明，等.阿霉素致心肌细胞凋亡时网腔钙结合蛋白的变化[J].临床心血管病杂志,2015,31(8):895-898.

The effect of astragalus injection on the expression of endoplasmic reticulum stress chaperonin GRP78 and GRP94 mRNA in adriamycin- injured cardiomyocytes with calumenin silencing by shRNA

MA Kui-ying，WAN Quan，WANG Yi-li，TAO Xie-xin，HUANG Xia，CHAI Hua，ZHAO Ming△

(The Inner-Mongolia National University Affiliated Hospital,Tongliao 028000,China)

Objective:To investigate the effect of astragalus injection on the endoplasmic reticulum stress in adriamycin(ADR)-injured cardiomyocytes with calumenin silencing by shRNA.Methods:Firstly,the stable lentiviral calumenin shRNAvector was constructed.Secondly,in vitro cultured neonatal rat cardiac myocytes were randomly divided into control group、normal group(3 mg/L ADR),lentivirus infection group(lentivirus infection+3 mg/L ADR),Astragalus group 1(3 mg/L ADR+Astragalus),Astragalus group 2(lentivirus infection+3 mg/L ADR+Astragalus).The mRNA epression level of calumenin expression and reticulum stress chaperone in GRP78,GRP94 of each group was monitored by real-time PCR.Results:①Compared with that of the control group,the calumenin mRNA expression in the normal group was reduced(P<0.05),yet its mRNA level in lentivirus the infection group and the Astragalus group 2 was further reduced(P<0.01).Compared with that of the normal group,the mRNA contents of calumenin in the Astragalus group 1 was increased(P<0.05).The expression of calumenin in Astragalus group 2 was increased comparing with lentivirus infection group(P<0.01).②Compared with that in the control group,the expression of reticulum stress chaperone in GRP78,GRP 94 in lentivirus infection group and normal group was significantly increased(P<0.01);Compared with that in the normal group,the expression of reticulum stress chaperone in GRP78,GRP94 in Astragalus group 1 was reduced(P<0.01);Compared with that in the lentivirus infection group,the expression of reticulum stress chaperone in GRP78,GRP94 in the Astragalus group 2 was obviously decreased(P<0.01).Conclusion:①Calumenin can alleviate endoplasmic reticulum stress induced by ADR-injured myocardial cells.②Astragalus injection can restrain the endoplasmic reticulum stress induced by adriamycin,which may be achieved by the calumenin protein.

adriamycin;astragalus;calumenin;endoplasmic reticulum stress;cardiomyocyte;suckling rat;eticulum stress;cardiomyocyte;suckling rat

2014-12-10

2015-11-02

△Tel：13474859991；E-mail:langzhe73@163.com

R331.3；R-332

A

1000-6834(2016)02-154-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.015