妥海燕，任　远,2△，王志旺,2△，程小丽，刘雪枫，李荣科，王瑞琼

(1.甘肃中医药大学,兰州 730000;2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室,兰州 730000)



当归挥发油对哮喘BALB/c小鼠的平喘作用及对Th17免疫活性的影响*

妥海燕1，任远1,2△，王志旺1,2△，程小丽1，刘雪枫1，李荣科1，王瑞琼1

(1.甘肃中医药大学,兰州 730000;2.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室,兰州 730000)

目的：探讨当归挥发油对哮喘BALB/c小鼠的平喘作用及对IL-17A、RORγt等Th17细胞活性因子的影响。方法：取雌性小鼠随机分为7组(n=12)：正常对照组、模型对照组、地塞米松组、当归挥发油高中低剂量组及当归油中+地米组，通过注射卵清白蛋白(OVA)致敏、吸入OVA激发的方法来复制哮喘动物模型，在当归挥发油的防治下，考察当归挥发油对哮喘行为学、肺功能、肺组织病理学、血清IL-17A及肺组织RORγt表达的影响。结果：60、120、240 mg/kg当归挥发油可维持哮喘小鼠体重的正常增长，改善哮喘行为学、肺功能及肺组织病理学变化，抑制IL-17A与RORγt的过度表达(P<0.05,0.01)。同时，当归挥发油与地塞米松配伍后对维持体重的正常增长、缓解IL-17A与RORγt的过度表达具有一定的协同作用。结论：当归挥发油具有明显的防治哮喘作用，抑制IL-17、RORγt过度表达而抑制Th17细胞免疫活性是其作用机制之一；而当归挥发油与糖皮质激素配伍后有一定的协同作用。

当归挥发油；BALB/c小鼠；平喘；Th17细胞

中药当归(Angelica Sinensis(oliv.)Diels)为常用药材之一，有“十方九归”之称。《神龙本草经》中记载当归具有“主咳逆上气”的功效，当归治疗呼吸系统疾病的中医理论与临床应用在历代中医药著作中都有详细的记载，例如《本草经疏》记载当归“甘以缓之，辛以散之润之，温以通之畅之。活血补血之要药，故主咳逆上气也”；药理学研究显示，当归挥发油对豚鼠气管平滑肌有明显的解痉作用[1]。近年来研究表明，作为T细胞亚群的Th17细胞免疫异常及其活性因子IL-17A、维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid-related orphan receptor gamma t,RORγt)等的过度表达与哮喘有密切的关系[2]。本次研究采用卵清白蛋白(OVA)复制哮喘BALB/c小鼠模型，探讨当归挥发油的平喘作用及对Th17细胞免疫活性(IL-17A、RORγt等)的影响，为当归及其挥发油防治哮喘提供理论依据。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

甘肃省岷县康达药业开发有限责任公司的当归挥发油(超临界CO2萃取)，生产批号：20150313；国药集团容生制药有限公司的地塞米松磷酸钠注射液(dexamethasone)，国药准字H41020036，批号13011911；Grade V Sigma公司的卵清白蛋白(OVA)、氯化乙酰胆碱及磷酸组胺，批号：SLBF0342V、BCSK5705V、WXBB2337V；深圳达科为生物技术有限公司的IL-17A试剂盒(ELISA)，产品批号E3040-1412-3；北京博奥森生物技术有限公司的维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)试剂盒(免疫组化)，批号AD082522；上海大众制药厂的吐温-80，生产批号：70093。实验时，采用干胶法用吐温-80将当归挥发油配制成乳状液，另取吐温-80配制0.5%的空白对照液，冰箱冷藏备用。

1.2仪器

CHT(CH Technologies)鼻暴露/全身暴露吸入染毒系统(USA)，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司的超声雾化器(402AI型)，北京广源达科技发展有限公司的动物肺功能检测系统(EMKA型)，北京赛多利斯仪器有限公司的电子分析天平(BS1103型)，上海安亭科学仪器厂的高速冷冻离心机(TGL-16G型)，上海第三分析仪器厂的分光光度计(722型)，成都泰盟科技有限公司的医学图像分析系统(BI-2000型)，日本Olympus的光学显微镜(CH-212型)。

1.3动物

SPF级雌性BALB/c小鼠，体质量16～20 g，由兰州兽医研究所(中国农业科学院)提供，动物许可证62000600000082；科研实验动物中心(甘肃中医药大学)饲养，实验动物实施使用号00000115。

1.4分组、造模及给药

将84只雌性小鼠[3-5]按体质量随机分为7组，每组12只，自由进食进水，适应性饲养1周。实验第1天开始致敏，6组小鼠每只腹腔注射新鲜配制的致敏液(为内含OVA100 μg、氢氧化铝3 mg的生理盐水混悬液)0.2 ml，同时背部皮下注射致敏液0.2 ml，正常对照组以生理盐水(NS)代替致敏；第8天依上法再致敏一次。第15天开始激发，即将小鼠置于动物用CHT鼻暴露/全身暴露吸入染毒系统中，加入激发液(1% OVA)，调节雾化速度至2 ml/min，使小鼠均匀吸入激发液20 min，隔日一次，连续激发28 d，正常对照组以NS代替激发。从实验第15天开始，地塞米松组(地塞米松0.5 mg/kg)、当归挥发油高、中、低剂量组(当归挥发油240、120、60 mg/kg)及当归油中+地米组(挥发油中剂量与地塞米松组，当归挥发油120 mg/kg、地塞米松0.5 mg/kg)灌胃给予相应药物，模型对照组与正常对照组小鼠灌胃空白对照液20 ml/kg，每天一次，连续给药28 d。

1.5支气管激发实验

在整个实验过程中的第28天和42天测定，配制含0.2%组胺与2%乙酰胆碱的混合激发液，将小鼠置于动物用CHT气溶胶/烟雾染毒暴露系统内，2 ml/min雾化吸入混合激发液120 s，从雾化开始观察10 min内小鼠抓鼻、挠痒及哮喘发作症状等哮喘行为学指标并评分。具体评分标准：小鼠没有抓鼻或挠痒动作记为0分；抓鼻或挠痒出现1～3次记1分，4～6次记2分，7次及以上记3分；小鼠无哮喘症状记0分，出现轻微的哮喘症状记为3分，出现呼吸急促、或呼吸频率明显加快或焦躁不安等哮喘症状记6分，出现严重的呼吸困难如急促点头、腹式呼吸等哮喘症状记9分。

1.6肺功能测定

实验第42天，将小鼠置于肺功能检测系统中，启动系统，在时间与事件模式下测定小鼠的肺功能。结合动物肺功能仪检测的指标，本次实验对哮喘小鼠吸气峰流量(peak inspiratory flow,PIF)、呼气峰流量(peak expiratory flow,PEF)、潮气量(tidal volume,TV)及呼吸频率(respiratory rate,F)等肺功能指标进行检测。

1.7相关细胞因子及蛋白表达等指标测定

实验过程中观测小鼠的体重、饮食、饮水等一般情况。实验第43天，麻醉动物、眼球取血，分离血清，测定IL-17A的含量。处死小鼠，摘取肺脏，于固定位置取肺组织，经甲醛固定、切片、染色等步骤制片，镜下观察肺组织病理学特点，对支气管及其周围肺组织炎症细胞浸润程度进行半定量分析；另取肺组织切片经免疫组化染色，观察RORγt蛋白表达位置并对其进行半定量分析。

1.8统计学分析

2　结果

2.1当归挥发油对哮喘小鼠体重的影响

正常对照组BALB/c小鼠在激发过程中没有明显变化，模型对照组小鼠激发后逐渐出现挠痒、抓鼻等症状，有些动物出现呼吸异常。经当归挥发油干预后上述症状得到不同程度的缓解。实验开始时各组小鼠的体重没有明显差异，实验第43天模型对照组小鼠的体重明显偏小，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表1)；与模型对照组比较，当归挥发油各剂量组小鼠的体重明显增加(P<0.05,0.01)。同时，当归油+地米组的体重增加明显，与地塞米松组比较有统计学意义(P<0.05)。

GroupDose(mg/kg)0d42dBodyweight(g)Bodyweight(g)Control-17.3±1.121.9±1.8Model-17.7±1.319.6±1.6*Dexamethasone0.517.7±1.119.5±1.4High24017.1±0.921.7±1.8##Middle12016.9±0.921.1±1.4#Low6017.6±1.321.0±1.5#Middle+Dexamethasone120+0.516.9±1.221.2±1.6#△

VOR:Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis

*P<0.05 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group;△P<0.05 vs dexamethasone group

2.2当归挥发油对哮喘小鼠支气管激发实验过程中哮喘行为学的影响

实验结果显示，模型对照组小鼠吸入混合激发液后哮喘行为学综合评分值明显升高，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表2)；经当归挥发油防治后，哮喘行为学综合评分明显下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05,0.01)。

GroupDose(mg/kg)Asthmaticbehaviorsscore28d42dControl-1.8±0.81.9±0.7Model-3.8±1.4**5.4±1.9**Dexamethasone0.52.1±1.2##2.8±1.5##High2402.2±1.1##2.9±1.7##Middle1202.3±1.1##3.0±1.9##Low602.8±1.53.3±2.0#Middle+Dexamethasone120+0.51.9±0.9##2.0±1.6##

VOR:Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis

**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.3当归挥发油对哮喘小鼠肺功能的影响

肺的功能包括肺通气(pulmonary ventilation)与肺换气，此处所讲的肺功能主要是指肺通气的功能，即肺与外界环境之间的气体交换功能。实验结果显示，模型对照组小鼠的PIF、PEF、TV明显下降，而F明显增加，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表3)；在当归挥发油的干预下，PIF、PEF、TV上升，F降低，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05,0.01)。

Tab.3　Effect of VOR on respiratory function of asthmatic mice ±s,n=12)

VOR:Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis;PIF:Peak inspiratory flow;PEF:Peak expiratory flow;TV:Tidal volume;F:Respiratory rate

**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.4当归挥发油对哮喘小鼠肺组织病理学的影响

经HE染色后，正常对照组小鼠肺组织病理变化不明显(图1A)，而模型对照组动物肺组织可见明显的病理变化：支气管上皮细胞肿胀、部分脱落，基底膜变厚，支气管壁充血、结构模糊(图1B)。经当归挥发油干预后，小鼠上述肺组织病理变化有一定的缓解(图1D,图1E,图1F)。对支气管及其周围肺组织炎性细胞浸润程度进行半定量分析，结果显示当归挥发油对炎性细胞浸润程度有改善作用，其中高剂量组与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05，表4)。

Fig.1Effect of VOR on lung histopathology of asthmatic mice(HE staining ×20)

A:Control group;B:Model group;C:Dexamethasone group;D:High dose of VOR group;E:Middle dose of VOR group;F:Low dose of VOR group;G:Middle dose of VOR and dexamethasone group

VOR:Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis

Tab.4　Effect of VOR on inflamation cell infiltration in bronchus of asthmatic mice ±s,n=12)

VOR:Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis

**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

2.5当归挥发油对哮喘小鼠血清IL-17A的影响

实验结果显示，模型对照组小鼠血清IL-17A明显上升，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表5)；经当归挥发油干预后，IL-17A明显下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)。同时，当归油中+地米组IL-17A的含量更低，与地塞米松组比较有统计学意义(P<0.05)，提示当归挥发油与地塞米松有一定的协同作用。

2.6当归挥发油对哮喘小鼠肺组织RORγt表达水平的影响

在高倍视野下，细胞核或细胞浆呈棕蓝色染色者为转录因子RORγt表达阳性细胞，小鼠肺组织RORγt主要表达于气道周围及肺组织淋巴细胞等部位(图2A)。模型对照组小鼠RORγt的表达明显增强(图2B)，经当归挥发油干预后其表达强度有所减弱(图2D,E,F)。对RORγt表达强度进行半定量分析，结果显示，当归挥发油高、中、低剂量组小鼠肺组织RORγt表达的平均光密度值明显减弱，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01，表5)。同时，当归油中+地米组RORγt表达较地塞米松组减弱(P<0.05)，显示出一定的协同作用。

Fig.2Effect of VOR on RORγt expression in lung tissue of asthmatic mice(×40)

A:Control group;B:Model group;C:Dexamethasone group;D:High dose of VOR group;E:Middle dose of VOR group;F:Low dose of VOR group;G:Middle dose of VOR and dexamethasone group

3　讨论

哮喘是由T细胞、B细胞及嗜酸粒细胞等多种炎性细胞参与的气道炎症性疾病。近四十年来虽然采取包括糖皮质激素在内的综合治疗方案，但流行病学研究结果显示哮喘的患病率和死亡率并没有随之而降低[6]，开发新的平喘药物仍然非常迫切。当归为常用中药，其“主咳逆上气”受到自《本经》以来众多医家的肯定，以当归挥发油为主要有效部位的中药制剂在临床治疗哮喘中取得比较好的疗效[7,8]；现代药理学研究显示，当归挥发油对离体气管平滑肌具有明显的解痉作用[1]。本次研究采用经典的哮喘动物模型复制方法[9]，探讨当归挥发油防治哮喘的作用。实验发现，当归挥发油可改善哮喘BALB/c小鼠的物质代谢，维持其体重的正常增长。

GroupDose(mg/kg) IL-17A(pg/ml) RORγtControl-19.30±2.760.260±0.010Model-33.35±4.01**0.353±0.020**Dexamethasone0.523.91±3.14##0.272±0.011##High24025.41±3.18##0.279±0.014##Middle12026.62±3.28##0.309±0.015##Low6027.96±3.20##0.331±0.015##Middle+Dexametha-sone120+0.520.68±2.54##△0.262±0.012##△

VOR:Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis;IL-17A:Interleukin-17A;RORγt:Retinoid-related orphan receptor gamma t

**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group;△P<0.05 vs dexamethasone group

痰、咳、喘是哮喘临床常见症状，但小鼠的咳嗽声音太小而不宜察觉，痰液难以量化，唯有哮喘引起的症状有明显的特征而易于量化，哮喘可引发呼吸异常，如呼吸急促甚至呼吸伴有点头、腹式呼吸等，以及缺氧而引发的神经系统症状，如焦躁不安、直立静坐或急促爬刨垫料等异常行为。采用OVA复制的哮喘属于过敏性哮喘，动物会出现鼻腔与皮肤发痒，因此抓鼻、挠痒也属于易量化的指标。本次研究对小鼠吸入组胺与乙酰胆碱后抓鼻、挠痒及哮喘发作症状等哮喘行为学指标进行评价，结果显示当归挥发油可明显降低BALB/c小鼠哮喘过程中行为学综合评分值，改善激发过程中小鼠哮喘的症状。肺组织病理学与肺功能是反应肺脏结构与功能的最直观指标，实验结果显示，当归挥发油可缓解肺组织炎性细胞浸润程度等病理变化而改善肺组织病理学，提高呼气峰流量、吸气峰流量及潮气量、降低呼吸频率而改善肺换气功能。

哮喘是一种慢性炎症性疾病，而炎症与免疫系统有密切的关系；随着2005年发现Th17(T help cell 17)以来[10]，人们对哮喘的免疫反应机理有了更全面的认识。Th17细胞在防御胞外细菌感染和介导以慢性炎症为损伤机制的自身免疫性疾病中发挥重要作用，其增殖、分化及功能的发挥与白细胞介素17(IL-17)、维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)等活性因子有密切的关系。IL-17主要来源于Th17细胞，为Th17细胞的特异性细胞因子，IL-17可以通过募集并活化中性粒细胞、巨噬细胞等方式而发挥促炎作用，参与哮喘等疾病的炎症反应过程，如通过加重肺部炎症、提高呼吸道反应性、促进支气管重构而加重哮喘[11,12]。RORγt是Th17细胞的特异性转录因子，能诱导初始T细胞分化成Th17细胞并分泌IL-17而间接发挥上调炎症反应的作用，RORγt缺失则可导致Th17细胞的分化不足及IL-17水平的下降[13,14]。本次实验结果显示，当归挥发油可降低哮喘小鼠IL-17A的水平及肺组织RORγt表达强度，提示当归挥发油可抑制Th17细胞异常升高的免疫活性。

糖皮质激素是哮喘临床最常用药物之一，但临床与实验研究显示[15,16]，糖皮质激素在治疗哮喘过程中常出现阴或/和阳虚损的证候；另一方面，中医药理论认为当归具有“主咳逆上气”之功，当归为补血活血之要药，味甘辛而性温，具有补血而养阴生津、活血而行气散津、和血而润肺降气之功效。实验结果显示，地塞米松配伍当归挥发油后有一定的协同增效趋势，特别是对动物体重增长缓慢有明显的缓解作用，对异常升高的IL-17、RORγt表达水平有更加明显的抑制作用，提示当归的补益阴血津液、活血行气布津的功效可以缓解糖皮质激素引起的阴或/和阳虚损证候，显示出一定的减毒增效作用。

综上所述，当归挥发油具有缓解哮喘行为学、改善肺功能及肺组织病理学，抑制IL-17及RORγt的过度表达，通过调节Th17细胞免疫活性而达到平喘作用。

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Effects of VOR on asthmatic BALB/c mice and on immune-activity of Th17 cells

TUO Hai-yan1,REN Yuan1,2△,WANG Zhi-wang1,2△,CHENG Xiao-li1,LIU Xue-feng1,LI Rong-ke1,WANG Rui-qiong1

(1．Gansu University of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000;2．Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicine of Gansu Province,Lanzhou 730000,China)

Objective:To study the anti-asthmatic effects of Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis(VOR,Traditional Chinese Medicine)on asthmatic BALB/c mice and its effect on Th17 cell immuno-activity through IL-17A and RORγt.Methods:After grouping(n=12),the asthmatic BALB/c mice were replicated through injection of ovalbumin(OVA)for sensitization and administration of OVA aerosol for challenge and then,the asthmatic behaviors,respiratory function,lung histopathology as well as levels of IL-17A in serum and retinoid-related orphan receptor gamma t(RORγt)in lung tissue were observed after the action of VOR.Results:VOR could maintain normal growth of body weight in asthmatic mice,improve asthmatic behaviors,respiratory function,lung histopathology and,inhibit over-expression of IL-17A and RORγt(P<0.05,0.01)at 60,120,240 mg/kg doses.The combination of VOR and dexamethasone could bring synergistic effects on growth of body weight and expression of IL-17A and RORγt.Conclusion:VOR has significant effects of anti-asthma and one of the mechanisms is to inhibit immune activity of Th17 cell through relieving over-expression of IL-17 and RORγt.Besides,the combination of VOR and glucocorticoid could bring synergistic effects.

Volatile oil of Radix Angelicae Sinensis(VOR);BALB/c mice;antiasthma;Th17 cell

国家自然科学基金项目(81460668)；甘肃省自然科学基金项目(1310RJZA086)；甘肃中医药大学研究生创新基金项目(2015CX23)

2015-09-17

2016-01-25

△Tel:0931-8765395;E-mail:13893109787@126.com,wzw0933@126.com

R562.25；R285.5

A

1000-6834(2016)02-137-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.011