杨成芳, 李　丽, 李勇文, 钟毓娟, 熊美丽, 方舒萍

(桂林医学院 药学院, 广西 桂林　541004)



两种不同给药计算方法对体外药效实验结果的影响

杨成芳, 李丽, 李勇文, 钟毓娟, 熊美丽, 方舒萍

(桂林医学院 药学院, 广西 桂林541004)

目的:研究按浓度与按单个细胞药物含量两种不同计算方法对甲基阿魏酸(methyl ferulic acid,MFA)抑制TGF-β1刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)α-SMA表达的影响,评价两种给药计算方法在细胞实验中的应用效果。方法:体外培养HSC-LX2,MTT法测定MFA抑制HSC-LX2增殖的作用,由此确定MFA 1.25 、2.5、5 mg/L(其相应的单个细胞MFA含量为1.13×10-7、2.25×10-7和4.5×10-7mg)3个浓度进行后续的实验；以两种不同的细胞数量接种到培养皿,分别以上述浓度和单个细胞MFA含量干预72 h,采用RT-PCR检测细胞α-SMA mRNA的表达和Western blotting检测细胞内α-SMA蛋白含量。结果:在两种不同细胞数量情况下,以单个细胞MFA含量计算方法干预后,相同MFA含量组α-SMA mRNA和蛋白的表达趋势一致,且与MTT结果相吻合；而以浓度计算方法干预后,相同MFA浓度组α-SMA mRNA和蛋白表达差异较大。结论:以单个细胞药物含量计算方法在MFA对HSC-LX2细胞体外药效实验中的应用效果更稳定,更科学,实验可重复性较好。

细胞实验； 给药计算方法； 药物效应； 甲基阿魏酸

药物剂量与药物效应有着密切的关系,两者在一定范围内成比例,剂量变化后会产生剂量相关靶的激活,随之药物的作用会发生质或量的变化[1]。所以在评价药物效应的实验中,药物剂量的作用是不容忽视的。目前在细胞实验中最常用的给药计算方法有按质量分数、体积分数和摩尔浓度等。课题组前期研究发现,甲基阿魏酸抑制HSC-LX2增殖与活化细胞实验按浓度给药方式得出的实验结果会随着接种到培养皿的细胞数量的变化而变化,同时,结合动物实验给药方式的选择——按体重或者按体表面积计算,作者认为药物效应与单个细胞药物含量有关。因而,本研究分别按质量浓度和单个细胞药物含量两种给药计算方法进行药物干预,观察不同细胞数量情况下两种给药计算方法对实验结果的影响,探讨一种更实用、更科学的细胞实验的给药计算方法。

1　材料与仪器

细胞来源:人肝星状细胞株(HSC-LX2),BioHermes。

药物与试剂:甲基阿魏酸(MFA),化学名为3,4-二甲氧基肉桂酸(sigma公司,批号:101236152)；高糖DMEM培养基、胎牛血清,Hyclone；TGF-β1,novoprotein,批号PO1137；RNApure高纯总RNA快速提取试剂盒,北京艾德莱生物,批号130127；TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒,TIANGEN,批号RT120420；2×Taq PCR Master Mix 北京艾德莱生物,批号KT201-01；鼠抗人GAPDH /α-SMA单克隆抗体,Aidlab ；Biotech- nologies； HRP 标记兔抗鼠二抗,北京中杉金桥生物技术有限公司。

主要仪器:CO2培养箱(美国Thermo,Model 311)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf,5804R)；多通道PCR 仪(美国MJ公司,PTC-220)；核酸蛋白测定仪( 日本岛津)；倒置相差显微镜(德国蔡司产品)；DYY-6D凝胶电泳仪/电泳槽(北京赛因坦科技有限公司),培清JS-780全自动凝胶成像分析系统(上海培清科技),蛋白电泳仪/电转膜仪—JY600C(上海生工)。

2　实验方法

2.1细胞培养

人肝星状细胞系HSC-LX2,置于含10%胎牛血清、100 U / mL青霉素和100 nmol/L链霉素的高糖DMEM培养液中,37 ℃、5%CO2条件下培养,隔天换液,待细胞长至80%密度时,用0.25%EDTA胰蛋白酶消化,每2～3 d传代1次,每次实验均取呈指数生长的细胞进行。

2.2MTT法检测MFA对TGF-β1刺激的HSC-LX2增殖的影响

MTT操作步骤参照文献[2-4]方法进行。模型组仅含终质量浓度为1 μg/L的TGF-β1刺激,各药物组含终质量浓度为1 μg/L的TGF-β1和终质量浓度分别为0.312、0.625、1.25、2.50、5、10、20、40 mg/L的MFA,计算细胞增殖抑制率,由此确定后续实验的药物浓度和单个细胞药物含量。

2.3实验分组及给药

将HSC-LX2细胞接种于φ为10 cm的培养皿,每个培养皿细胞数分别为5×104和10×104个,各16皿。实验设立正常对照组、TGF-β1刺激的模型组、按浓度为1.25、2.5、5 mg/L组和按单个细胞MFA含量为1.13×10-7、2.25×10-7、4.5×10-7mg组。细胞贴壁良好后,除空白对照组外,模型组加入终质量浓度为1 μg/L的 TGF-β1刺激,各给药组加入终质量浓度为1 μg/L的 TGF-β1含各浓度药液10 mL的培养液,继续培养72 h。采用Trizol法抽提细胞中总RNA和低温提取细胞中总蛋白。

2.4RT-PCR检测HSC-LX2细胞α-SMA mRNA的表达

RT-PCR法参照文献[3-4]进行。用Primer Premier 5.0自行设计引物,引物序列见表1。PCR反应参数:94℃预变性3 min ；94 ℃变性30 s；53 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min；共35个循环。反应结束后取10 μL RT-PCR产物及8 μL DNA marker进行2%琼脂糖凝胶电泳, 结果经全自动凝胶成像分析系统进行分析,样本α-SMA mRNA PCR产物条带的光密度与内参β-actin mRNA PCR产物条带的光密度(OD)比值作半定量分析。重复3次,取平均值进行统计分析。

表1　α-SMA和 β-actin的上下游引物序列

2.5Western blotting检测细胞内α-SMA蛋白含量

Western blotting参照文献[5-6]进行。所得胶片经全自动凝胶成像分析系统进行灰度值分析。重复3次,取平均值进行统计分析。

2.6统计分析

3　结果

3.1MFA对HSC-LX2细胞增值的影响

如图1所示：当MFA质量浓度在0.31～5.0 mg/L之间时,MFA对HSC-LX2的增殖抑制作用与MFA浓度成正相关；在5.0～40.0 mg/L之间时成负相关；MFA在5 mg/L对HSC-LX2的增殖抑制作用最大。故选用浓度较小、抑制作用较大的1.25、2.5、5 mg/L(其相应的单个细胞MFA含量分别为1.13×10-7、2.25×10-7、4.5×10-7mg)3个浓度进行后续实验。

图1　MFA对HSC-LX2细胞增值的影响(n=3)

3.2两种不同给药计算方法对MFA抑制细胞α-SMA mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示, 按浓度给予MFA干预72 h后,接种至培养皿的细胞数为5×104时,与模型组比较,MFA 2.5 mg/L组抑制α-SMA mRNA的表达效果最好(P<0.01),而1.25 mg/L和5 mg/L两组的效果相当(P<0.05)；在细胞数为10×104时,与模型组比较,1.25 mg/L组无显著性差异,而2.5 mg/L和5 mg/L两组有显著差异(P<0.01),(见图2和表2)。按单个细胞MFA含量给药72 h后,两种不同细胞数量情况下,各个相同MFA含量组α-SMA mRNA表达趋势一致,如表3和图3所示,与模型组比较,2.25×10-7、4.5×10-7mg/个两组有显著差异(P<0.01),1.13×10-7mg/个组无统计学差异。

图2　按MFA浓度给药对细胞α-SMA mRNA表达的影响

组别质量浓度mg·L-1α-SMA/β-actin接种细胞数为5×104接种细胞数为10×104正常对照组—0.298±0.0240.355±0.051模型组—0.802±0.080**0.708±0.087**甲基阿魏酸1.250.687±0.077△0.623±0.077甲基阿魏酸2.50.208±0.019△△0.241±0.037△△甲基阿魏酸5.00.657±0.071△0.141±0.023△△

注:与正常对照组比较,**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

表3　按单个细胞MFA含量给药对细胞α-SMA mRNA表达的影响

注:与正常对照组比较,**P<0.01；与模型组比较,△△P<0.01。

图3　按单个细胞MFA含理对细胞α-SMA mRNA表达的影响

3.3两种不同给药计算方法对MFA抑制细胞α-SMA蛋白表达的影响

Western blotting结果显示, 按浓度给予MFA干预72 h后,接种至培养皿的细胞数为5×104时,与模型组比较,MFA 2.5 mg/L组抑制α-SMA 蛋白的表达效果最好(P<0.01),而1.25 mg/L和5 mg/L两组的效果相当(P<0.05)；在细胞数为10×104时,与模型组比较,1.25 mg/L组无显著性差异,而2.5 mg/L和5 mg/L两组有显著性差异(P<0.01),见图4和表4。按单个细胞MFA含量给药72 h后,两种不同细胞数量情况下,各个相同MFA含量组α-SMA 蛋白表达趋势一致,如图5和表5所示,与模型组比较,2.25×10-7mg/个和4.5×10-7mg/个两组呈显著差异(P<0.01),1.13×10-7mg/个组无统计学差异。

图4　不同细胞数按MFA浓度给药对细胞α-SMA 蛋白表达的影响

组别质量浓度mg·L-1α-SMA/GAPDH接种细胞数为5×104接种细胞数为10×104正常对照组—0.388±0.0340.325±0.043模型组—0.966±0.098**0.833±0.068**甲基阿魏酸1.250.812±0.078△0.762±0.069甲基阿魏酸2.50.288±0.021△△0.406±0.044△△甲基阿魏酸5.00.804±0.080△0.351±0.035△△

注:与正常对照组比较,**P<0.01；与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01。

表5　按单个细胞MFA含量给药对细胞α-SMA蛋白表达的影响

注:与正常对照组比较,**P<0.01；与模型组比较,△△P<0.01。

4　讨论

目前多数学者认为抑制HSCs的活化与增殖是治疗肝纤维化的最重要的策略[7-8],逆转肝纤维化关键在于减少活化的HSCs数量[9-10]。HSCs活化时具有高度增殖活性和转化为高表达α-SMA的肌成纤维细胞,合成大量细胞外基质；反之,α-SMA又可诱导HSC的增殖、活化,表达更多的α-SMA,故α-SMA的表达被认为是HSC活化的显著特征之一[11]。因此,本实验拟用α-SMA mRNA与蛋白的表达情况作为评判MFA抑制HSC-LX2增殖与活化的效应指标。

图5　不同细胞数按单个细胞MFA含量给药对细胞α-SMA 蛋白表达的影响

在细胞实验中,药物效应是药物分子与细胞之间直接的相互作用,细胞原有功能水平的改变,与细胞密度、细胞上受体位点的多少及亲和力及细胞所处的微环境等有关[12]。本研究的RT-PCR与Western blotting 实验结果均显示:在接种至培养皿的细胞数量不同的情况下,按MFA浓度给药干预后,相同的MFA浓度组细胞α-SMA的表达差异较大,比如细胞数为5×104时,与模型组比较,MFA 2.5 mg/L组抑制α-SMA 的表达效果最好(P<0.01),而另外两组的效果相当(P<0.05),但是在细胞数为10×104时,与模型组比较,1.25 mg/L组无显著性差异,而2.5 mg/L和5 mg/L有显著性差异(P<0.01)；而按单个细胞MFA含量给药干预后,各个相同MFA含量组α-SMA表达趋势一致,且与MTT结果相符。在本实验中,接种细胞数为10×104个按浓度给药的实验结果与两种不同细胞数量情况下按单个细胞MFA含量给药的实验结果是一致的,预示在合适的细胞密度情况下按浓度给药也会得到可靠的实验结果,这就要求在接种细胞时要严格控制接种的细胞数量。

综上所述,按单个细胞药物含量给药在MFA对HSC-LX2细胞体外药效实验中的应用更稳定、更实用、更科学,实验重复性较好。

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Effect of two different dosage calculation methods on results of pharmacological experiment in vitro

Yang Chengfang, Li Li, Li Yongwen, Zhong Yujuan, Xiong Meili, Fang Shuping

(College of Pharmacy, Guilin Medical Institute, Guilin 541004, China)

Objective: To research the effect of two defferent dosage calculation methods (according to the concentration of drug and according to the drug content of single cell) on Methyl ferulic acid (MFA)which can inhibit the alpha SMA(α-SMA) expression in human hepatic stellate cells (HSC-LX2) stimulated by TGF-beta1 in vitro. Methods: HSC-LX2 cells were cultured in vitro, and the inhibition role of cells proliferation by MFA was tested by MTT method, thus determining MFA 1.25, 2.5 and 5 mg/L (the corresponding single cell MFA contents are 1.13×10-7,2.25×10-7and 4.5×10-7mg, respectively) 3 concentrations for subsequent experiments by MTT results. The quantity of two different cells was inoculated to the petri dish, then respectively by the concentration and the content of single cell above-mentioned for drug intervention for 72 hours, the mRNA expressions of α-SMA were assayed by RT-PCR and the protein content of α-SMA was mesured by Western blotting. Results: Under the condition of two kinds of different cells, according to calculation method of single cell drug content for drug intervention, the trend of the α-SMA mRNA and protein expression was consistent in the same content of MFA group, which was conformity with the results of MTT; but according to calculation method of concentration for drug intervention, the mRNA and protein expressions of α-SMA were quite different in the same MFA concentration group. Conclusion: The application effect of dosage calculation method according to the drug content of single cell in the pharmacological experiment of MFA acting on HSC-LX2 cells in Vitro is more stable and more scientific, and the experimental repeatability is good.

cytology experiment; dosage calculation method; pharmacological effect; methyl ferulic acid

DOI：10.16791/j.cnki.sjg.2016.01.010

2015- 06- 26修改日期:2015- 08- 17

国家自然科学基金资助项目(81360497)

杨成芳(1980—),女(壮族),广西扶绥,医学硕士,实验师,主要从事肝纤维化、类风湿关节炎药效学研究

E-mail:308823789@qq.com

李勇文(1969—),男,广西柳州,教授,硕士生导师,研究方向为抗肝炎、纤维化药物研究.

E-mail:liyongwen99@163.com

Q2-33

B

1002-4956(2016)1- 0035- 05