窦梦云，何淑芳，黄　成，潘永露，张　野

(安徽医科大学第二附属医院麻醉科，安徽 合肥　230601)



慢病毒介导的NGF基因沉默对PC12细胞分化的影响

窦梦云，何淑芳，黄成，潘永露，张野

(安徽医科大学第二附属医院麻醉科，安徽 合肥230601)

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.024

目的探讨慢病毒介导的神经生长因子(nerve growth factor，NGF)基因沉默后对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocytoma cell，PC12)分化的影响及其机制。方法构建NGF shRNA慢病毒载体。培养PC12细胞，随机分为5组(n=3)：① 正常对照组(NC)：PC12细胞置于DMEM/HG细胞培养液和促感染试剂polybrene中培养；② 空病毒感染组(LV CON)：PC12细胞置于空病毒和polybrene中培养；③ 慢病毒NGF shRNA1感染组(LV shNGF1)：PC12细胞置于慢病毒NGF shRNA1和polybrene中培养；④ 慢病毒NGF shRNA2感染组(LV shNGF2)：PC12细胞置于慢病毒NGF shRNA2和polybrene中培养；⑤ 慢病毒NGF shRNA3感染组(LV shNGF3)：PC12细胞置于慢病毒NGF shRN3和polybrene中培养。处理结束后，荧光显微镜下检测感染效率、荧光定量RT-PCR法检测细胞 NGF mRNA表达水平、Western blot法检测慢病毒感染后细胞NGF、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p- ERK1/2)蛋白表达，细胞增殖检验试剂(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞活性，显微镜下观察PC12细胞形态，统计细胞突起长度和最大细胞直径。结果慢病毒感染PC12细胞的效率超过90%。与NC组相比，LV shNGF3组NGF mRNA表达降低(P<0.05)，NGF蛋白水平明显降低(P<0.05)，ERK1/2蛋白表达和细胞活性无差异，p-ERK1/2蛋白表达有明显下降(P<0.01)，细胞形态发生明显变化，细胞突起长度和最大细胞直径均变小(P<0.01)，细胞分化被抑制。结论慢病毒介导的NGF基因沉默通过抑制ERK1/2活化，影响PC12细胞分化。

慢病毒；NGF；基因沉默；PC12细胞；分化；ERK1/2

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是神经营养因子家族中重要一员，其在感觉神经和交感神经的生长发育中发挥着至关重要的作用[1]。大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocytoma cell，PC12)是大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株，由于其可在NGF诱导下向交感神经元样细胞分化，目前广泛用于神经细胞功能等的研究。研究证实，NGF与细胞膜上受体酪氨酸激酶A(tyrosinekinase A，TrkA)结合，调节交感神经等的再生和分布[2]。同时，研究证实，细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)参与了NGF诱导的PC12细胞分化。……