索 磊，杨印祥，栾 佐



·论著·

·方法学研究·

含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定

索 磊，杨印祥，栾 佐

目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体，并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月，根据GenBank数据库中报道的人LINGO-1基因序列，设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列，并将其克隆至重组质粒载体，测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组)，并转染至人胶质细胞瘤细胞U251，荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)法检测LINGO-1 mRNA表达水平，采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体，经过包装分别得到滴度为2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后，实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1，经慢病毒载体转染后，实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平(0.09±0.01)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=12.87，P<0.01)，实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。实验组LINGO-1表达水平(0.28±0.02)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。结论本研究成功构建了含人LINGO-1 shRNA干扰载体，并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果，为研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。

慢病毒属；RNA干扰；LINGO-1

索磊，杨印祥，栾佐.含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定[J].中国全科医学，2016，19(24)：2962-2966.[www.chinagp.net]

SUO L,YANG Y X,LUAN Z.Construction and identification of lentiviral interference vector that including human LINGO-1[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2962-2966.

中枢神经系统损伤后如何有效地促进神经元的轴突再生、突触形成，已经成为当前神经再生领域研究的热点，近年来研究发现，LINGO-1在多种中枢神经系统损伤动物模型中表达明显升高，其可能在神经再生过程中发挥了重要的负调控作用[1-2]；而RNA干扰(RNA inference,RNAi) 作为一种新兴基因治疗手段,能够特异性抑制目的基因的表达，为进一步研究LINGO-1在调控神经元增殖和分化的发生、发展中的功能机制提供了新的研究方法[3-4]。……