李鑫玲，孙晓菲，李欣

α-淀粉酶产生菌的筛选鉴定及其发酵条件的优化

李鑫玲，孙晓菲，李欣

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003）

从土壤样本中分离出一株产α-淀粉酶的菌株，经形态学初步鉴定为热红短芽孢杆菌。对该菌株产酶条件进行了优化，确定其最佳碳源为麸皮，最佳氮源为明胶，最佳pH值为10，最佳初始装液量为60 mL。

α-淀粉酶；热红短芽孢杆菌；筛选；优化

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中。根据水解淀粉生成糖类产物的异头碳原子构型的不同可将淀粉酶分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶是商品化生产最早、应用最早、应用范围最广和用量最大的工业酶类之一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于燃料酒精、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业[1-2]。

本文对α-淀粉酶产生菌进行分离，并对其发酵条件进行优化，旨在为该菌的应用研究提供参考。发酵培养基。

1.2方法

1.2.1菌种初筛

称取5 g土壤样品溶于45 mL无菌水（含玻璃珠）中震荡10 min，上清液为菌原液。无菌水梯度稀释至10-7浓度。取10-5、10-6和10-7稀释度涂布于平板筛选培养基中，30℃培养48 h。选择有单菌落的平板，喷洒稀碘液观察有无透明圈，记录菌落特征，透明圈大小等。挑取透明圈明显且透明圈直径与菌落直径之比较大的单菌落斜面保藏，作为初筛菌株。

1.2.2菌种复筛及发酵方法

初筛菌株接种于50 mL种子培养基中30℃、150 r/min摇床培养24 h。种子液按10%的接种量接种于50 mL产酶液体培养基中，30℃、150 r/min摇床培养48 h后取发酵液4.5 mL于离心管中10 000 r/min离心5 min，取上清液测酶活，每个样品重复3次，最后结果求平均值。取酶活最高的一个作为复筛菌株。

1.2.3淀粉酶活的测定

YoungJ.Yo改良法[4]：取5 mL 0.5%的可溶性淀粉

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品

土样来源于河南洛阳，河南科技大学学校周围淀粉含量丰富的果园中，共采集45份土样，供分离用。

1.1.2培养基[3]

斜面培养基、平板分离培养基、筛选培养基、固态溶液，在40℃水浴中预热10 min，然后加适当稀释的酶液0.5 mL，反应5 min后，用5 mL 0.1 mol/L硫酸终止反应。取0.5 mL反应液与5 mL工作碘液显色，在620 nm处测光密度。以0.5 mL水代替0.5 mL反应液为空白，以不加酶液（加缓冲液）的管为对照。调整D使（R0-R）/R0在0.2～0.7之间。淀粉酶活计算公式如下：

酶活力/（U/mL）=（R0-R）/R0×D×50

式中：R0、R分别表示对照和反应液的吸光光度值；D为酶的稀释倍数。

酶活力单位定义：在40℃，pH6.0，1 g干曲5 min内水解1 mg淀粉（0.5%淀粉）的酶量为一个活力单位。

2　结果与分析

2.1菌种筛选

通过用含淀粉的平板筛选培养基进行培养，得到4株产酶较稳定的菌株，经产酶液体培养，发现5号菌株产酶能力最强。因此，选定5号菌株为本次筛选的结果，进行后续试验。

2.2菌株的鉴定结果

5号菌株为杆状兼性厌氧、革兰氏阳性菌，芽孢为圆形或椭圆，菌落呈乳白色，干燥，圆形，扁平，表面皱褶，边缘不整齐，不透明。接触酶试验阳性，甲基红试验阳性，明胶液化试验阳性，柠檬酸盐试验阴性，V.P.试验阴性。根据《常见细菌系统鉴定手册》与《伯杰细菌鉴定手册》初步判断此菌为热红短芽孢杆菌[5-6]。

2.3发酵条件优化

2.3.1不同碳源对产酶的影响

不同碳源对产酶的影响见图1。

图1　不同碳源对产酶的影响Fig.1　Effects of different carbon sources on enzyme production

碳源是微生物生命活动的重要能源物质，菌种对碳源的利用程度直接影响到酶的产量。结果显示，碳源的产酶顺序为麸皮，葡萄糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，糊精。以麸皮为碳源时酶活最高，糊精最低。故选麸皮作为碳源。

2.3.2不同氮源对产酶的影响

不同氮源对产酶的影响见图2。

图2　不同氮源对产酶的影响Fig.2　Effects ofdifferentnitrogen sources on enzyme production

由图2可知，添加不同氮源的产酶顺序为明胶、黄豆粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）H2PO4、NH4Cl、NaNO3。以明胶作为氮源时酶活最高，黄豆粉次之，无机盐较低。故选明胶作为最佳氮源。工业生产时考虑成本需求可选价格低廉的黄豆粉作为氮源。

2.3.3初始pH值对产酶的影响

在pH 6～pH12的范围内调节培养基的初始pH，结果见图3。

图3　初始pH值对产酶的影响Fig.3　Effects ofdifferentinitialpH on enzyme production

由图可知菌株在初始pH 8～pH11范围内酶活较高，其中pH值为10时酶活最高。

2.3.4装液量对产酶的影响

不同装液量影响摇床培养时的通气量，其对产酶的影响见图4。

图4　装液量对产酶的影响Fig.4　Effects of different amounts on enzyme production

由图4可知，酶活随着装液量的增加而增大，60 mL时达到最大，随后酶活有所下降。其原因是随着装液量的减少菌体浓度降低，故酶活低；而装液量过大时，通气较差，酶活也有所降低。故选60 mL为最佳装液量。

2.3.5底物（淀粉及葡萄糖）含量对产酶的影响底物含量对产酶的影响结果见图5、图6。

图5　淀粉含量对产酶的影响Fig.5　Effects ofstarch contenton enzyme production

图6　葡萄糖含量对产酶的影响Fig.6　Effects ofglucose contenton enzyme production

由图5可知，不含淀粉时酶活最高，随淀粉含量的增加酶活逐渐降低。可能是因为发酵液中菌体分解淀粉所致。

由图6可知，葡萄糖添加量为1%时酶活最大，之后随着葡萄糖添加量的增加酶活逐渐降低。其原因可能是葡萄糖是较容易被利用的碳源，当添加量适当时促进菌体生长，即促进产酶；但添加量过高时存在葡萄糖抑制作用，即抑制产酶。

2.3.6离子（Ca2+与Na+）含量对产酶的影响

离子（Ca2+与Na+）含量对产酶的影响见图7。

由图7可知，Ca2+促进产酶，其中0.2%～0.4%的Ca2+促进效果最好；Na+则抑制产酶，酶活力随着Na+含量的增加而降低。其原因可能是Ca2+使该酶保持适当构象，起到稳定作用；而Na+增加发酵液中盐离子浓度[7]。

图7　离子（Ca2+与Na+）含量对产酶的影响Fig.7　Effects ofion（Ca2+and Na+）content on enzyme production

3　结论

土壤中蕴含丰富的微生物资源，α-淀粉酶在微生物中分布广泛。从微生物中筛选出具有新特性和高活力的α-淀粉酶是一项非常有意义的工作。本研究从淀粉含量丰富的果园土壤中筛选出一株α-淀粉酶产生菌的菌株，经形态鉴定和生理生化鉴定，初步确定为热红短芽孢杆菌。对该菌株产酶条件进行了优化，确定其最佳碳源为麸皮；最佳氮源为明胶；最佳pH值为10；最佳初始装液量为60 mL；底物淀粉抑制产酶，1%的葡萄糖促进产酶；0.2%～0.4%的Ca2+促进产酶，Na+抑制产酶。

[1]洪新,唐克.耐酸性α-淀粉酶产生菌发酵条件的优化[J].中国畜牧兽医,2009,36(1):145-147

[2]蒋若天.一株产耐高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌的筛选与分离及产酶条件与酶学性质的研究[D].成都:四川大学,2007

[3]李江华,房峻.真菌α-淀粉酶产生菌的筛选及其固态发酵条件的初步研究[J].食品科学,2007(11):373-378

[4] 张强,刘成君,蒋芳,等.耐高温α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究[J].食品与发酵工业,2005(2):34-37

[5] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社, 2001:43-377

[6]R E布坎南,N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984:65-128

[7]刘雪峥,吴京平,何立千.浅析金属离子对α-淀粉酶活力的影响[J].中国酿造,2000(2):12-15

Identification of theα-Amylase Producing Strain and Optimization of the Fermentation Conditions

LIXin-ling，SUN Xiao-fei，LIXin
（Food and Bioengineering Department，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

Anα-amylase-producing strain was screened and isolated from soilsamples.The strain was preliminarily identified as B.thermonber by morphologic taxonomy.The lipase fermentation condition for the strain was optimized by studying on effect of nitrogen sources，carbon sources and other influence factors.The optimum carbon and nitrogen source was bran and gelatin.The optimum pH was 10 and the bestamountwas 60 mL.

α-amylase；B.thermonber；screening；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.038

李鑫玲（1982—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：畜产品加工及食品质量与安全。

2015-09-01