孔思远　吴　蓉　蔡双璠　谭红胜

(1 上海中医药大学，上海，201203; 2 中药创新药物研发上海高校工程研究中心，上海，201203)



夏枯草抗疱疹病毒多糖的提取及纯化工艺研究

孔思远1,2吴蓉1,2蔡双璠1,2谭红胜1,2

(1 上海中医药大学，上海，201203; 2 中药创新药物研发上海高校工程研究中心，上海，201203)

目的：优化夏枯草抗疱疹病毒多糖的提取及纯化工艺，为新药研究提供科学依据。方法：以多糖含量和浸膏得率为指标，采用L9(34)正交试验法对夏枯草多糖提取过程中的提取次数，加水倍量及提取时间3个因素进行优化研究；以多糖含量及体外抗单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)活性为考察指标，对超滤和醇沉两种纯化技术进行比较。结果：最优水提工艺为第1次加水14倍，第2、3次加水12倍，提取3次，每次提取时间1.5 h；采用超滤和醇沉两种技术分别纯化所得多糖。通过MTT法测得醇沉多糖和超滤多糖抑制HSV-1的IC50分别为(93.99±13.12)μg/mL和(51.35±15.30)μg/mL，结果表明超滤技术制备的多糖提取物抗单纯性疱疹病毒活性显著高于醇沉技术。结论：采用超滤技术制备的夏枯草多糖具有较高的含量及抗单纯性疱疹病毒活性，可作为夏枯草多糖开发新药的纯化工艺。

夏枯草；抗疱疹病毒；多糖；提取；纯化；醇沉；超滤

夏枯草为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗，因“夏至后即枯”而得名。具有清肝泄火，明目，散结消肿等功效。用于治疗目赤肿痛，目珠夜痛，头痛眩晕，瘰疬，瘿瘤，乳痈，乳癖，乳房胀痛等，民间饮用的历史已有1000多年。现代药理及化学成分研究证明，夏枯草主要含有三萜、黄酮、苯丙素、甾体、有机酸、挥发油及多糖类等成分[1]，具有降血压、降血糖、抗菌、抗病毒、调节免疫力等作用。从夏枯草中分离纯化的多糖有抗Ⅰ型单纯性疱疹病毒(HSV-1)和Ⅱ型单纯性疱疹病毒(HSV-2)的作用，其作用机制不同于目前临床药物阿昔洛韦(ACV)，可能不是直接作用于病毒的复制环节，而是阻止病毒吸附和穿入宿主细胞，以及促进淋巴细胞转化增殖和诱生干扰素等免疫调节作用，因此对标准病毒株和临床耐药株均有效，且不易产生耐药性[2-6]。

本实验拟采用L9(34)正交试验对水提多糖过程中的提取次数、加水倍量和提取时间进行优选，以体外抗单纯性疱疹病毒活性为评价指标，对超滤纯化多糖技术与传统的醇沉纯化多糖工艺进行比较，为后续将夏枯草多糖开发为抗单纯性疱疹病毒的新药提供科学依据。

1　仪器与材料

Spectrumlab 752S紫外-可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)，CPA2250电子分析天平(德国赛多利斯)，多功能酶标仪(BioTeK Power Wave XS2)，冷冻干燥机(Alpha 2-4 LD plus CHRTST)，Pellicon XL FILTER Ultrafiltration Cassettes(Millipore Corporation)，Labscale TFF System(Millipore Corporation)。

D-葡萄糖、95%乙醇、蒽酮、硫酸、DMSO(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、HSV-1 KOS病毒(美国ATCC公司)，MTT、台盼蓝(上海生工生物有限公司)，PBS磷酸盐缓冲盐(福建迈新试剂生物技术开发有限公司)，DMEM培养基、FBS(美国Invitrogen公司)，青霉素-链霉素(杭州吉诺生物有限公司)，ACV(中国药品生物制品检定所)。

夏枯草药材购于上海康桥中药饮片有限公司，经上海中医药大学中药学院生药教研室张红梅副教授鉴定为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗。

2　方法与结果

2.1夏枯草多糖的测定

2.1.1对照品溶液的配制精密称取无水葡萄糖对照品50.00 mg，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度(制成每1 mL含无水葡萄糖0.2 mg的溶液)，即得。

2.1.20.1%硫酸-蒽酮试剂的配制精密称取0.1 g蒽酮，加100 mL的80%硫酸溶液溶解，即得。

图1　硫酸-蒽酮法测定多糖含量标准曲线

2.1.3标准曲线的绘制分别精密量取对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.9 mL，置具塞试管中，加水至2.0 mL，精密加入0.1%硫酸-蒽酮溶液5 mL，摇匀，置水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却15 min，以相应的试剂为空白，参照紫外-可见分光光度法(2015年版《中华人民共和国药典》通则0401)，在625 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线(图1)，得回归方程为A=7.4443C+0.0302，r=0.9998。结果表明葡萄糖浓度在0.03～0.09 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4精密度试验精密量取同一标准品溶液，测定吸光度值，重复测定6次，求得吸光度值的RSD值为0.00%。说明该仪器的精密度良好。

表1　精密度试验结果

2.1.5稳定性试验精密量取夏枯草水提液样品溶液，按标准曲线的制备项下方法操作，每5 min测定1次吸光度，测定值在90 min内保持稳定，其RSD值为0.86%。表明处理后的提取液在90 min内测定过程中状态稳定。

表2　稳定性试验结果

2.1.6重复性试验取夏枯草药材粉约0.5 g，6份，精密称定，按已确定的提取方法提取，测定，其RSD值为2.09%，多糖含量为10.56 mg/g。

表3　重复性试验结果

2.1.7加样回收率试验称已知含量的夏枯草药材粗粉约0.25 g，共6份，精密称定，置圆底烧瓶中，加水50 mL，分别加入0.212 mg/mL的葡萄糖对照品水溶液0.8、1.0、1.2 mL各2份，加热回流提取90 min，提取液过滤，转移至50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取5 mL，加入95%乙醇25 mL，摇匀，4 500 r/min离心10 min，倾去上清液，沉淀加水溶解，转移至10 mL量瓶中，按拟定的含量测定方法测定，计算回收率。结果平均回收率为97.49%，其RSD值为2.17%。表明该测定方法准确。

2.2浸膏得率的测定参照浸出物测定法(2015年版《中华人民共和国药典》通则2201)，精密量取20 mL供试品溶液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量。

表4　加样回收率结果

2.3影响提取主要因素的优化选择提取次数、加水倍量、提取时间为考察因素，以夏枯草多糖含量(夏枯草多糖含量=多糖质量/药材质量)和浸膏得率为指标，采用L9(34)正交设计优选最佳水提工艺条件，因素与水平见表5。

表5　因素与水平

表6　正交试验的设计和结果

表7　多糖含量方差分析

称取夏枯草药材50 g，9份，按正交设计方案安排加热回流提取，滤过，合并水提液，加水定容至1 750 mL，摇匀，精密量取2 mL置15 mL离心管中，加入15 mL 95%的乙醇溶液，4 ℃下静置1 h，离心(4 000 r/min、10 min)，倾去上清液，沉淀加水溶解，转移至10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取供试品溶液2 mL，照标准曲线制备项下的方法测定，计算夏枯草中多糖含量和浸膏得率。对试验结果进行直观分析和方差分析，结果见表6～表9。

表8　正交试验的设计和结果

由分析结果可知，提取次数对多糖含量和浸膏得率均有显著性影响，提取时间对多糖含量有显著性影响而对浸膏得率无显著性影响，料液比对多糖含量和浸膏得率均无显著性影响，综合多糖含量和浸膏得率两个指标，从节约时间，降低能耗的生产实际出发，在保证提取充分的前提下，综合分析各个影响因素，拟定最佳工艺条件为A3B1C3，由于药材的吸水量为药材重量的2倍，考虑提取时料液能将药材浸没，选择料液比为12，因此最佳工艺为第1次加水14倍，第2、3次加水12倍，提取3次，提取时间1.5 h。

表9　浸膏得率方差分析

2.4验证试验对所选最佳提取工艺条件进行验证性试验，按优选的工艺条件进行验证，结果见表10，该水提工艺条件稳定性良好。

表10　水提多糖验证结果

2.5纯化工艺醇沉工艺：预实验结果显示50%乙醇浓度制备的夏枯草粗多糖纯度(夏枯草多糖纯度=多糖质量/浸膏质量)最高，抗单纯性疱疹病毒活性最好。因此，选择醇沉终浓度为50%。取夏枯草提取液浓缩至适当密度，加入乙醇使醇沉体积分数达50%，静置12 h，离心，收取沉淀，挥去乙醇，冻干，备用。

超滤工艺：预实验结果表明不同截留分子量制备的夏枯草粗多糖纯度无显著差异，而截留分子量50KDa所得的样品抗单纯性疱疹病毒活性最好。因此，选择截留分子量50KDa的滤膜。取夏枯草水提液原液200 mL过0.45 μm水相膜，滤液至于Labscale TFF System样品杯中连接50KDa Pellicon3® XL超滤膜包，将上下两压力表的压力差保持在10psi，并调节回流速度，当样品杯中剩余10 mL溶液时收集样品，冻干，备用。

对醇沉和超滤两种纯化工艺制备的样品进行夏枯草粗多糖的纯度测定(硫酸-蒽酮法测定含量，计算纯度)，结果见表11。

表11　粗多糖纯度n=6

表12　样本t检验

由表11和表12结果可见，超滤技术制备的粗多糖纯度高于传统的醇沉工艺，并且差异有统计学意义。

2.6毒性实验(MTT法)将Vero细胞计数后，以2×104/孔接种于96孔板，于37 ℃、5%CO2培养长满单层后，弃去培养液，再加入含不同浓度夏枯草多糖的培养基(200、100、50、25 μg/mL)，每浓度3个复孔，每孔200 μL，同时设正常细胞对照组和阳性药物对照组(ACV)。于37 ℃、5%CO2培养。培养72 h后，吸去培养液，加入MTT，培养4 h，加入DMSO，在570/650 nm波长下测定吸光度，计算CC50值。存活率=(药物组-病毒感染组)/(细胞组-病毒感染组)×100%。抑制率=(细胞组-药物组)/(细胞组-调零组)×100%。

由表13结果可见，夏枯草醇沉多糖和超滤多糖在1 600 g/mL浓度以下均无毒性。

表13　样本的CC50和抗HSV-1的IC50(MTT法)

表14　样本t检验

2.7体外抗疱疹病毒活性测定实验方法(MTT法)将Vero细胞计数后，以2×104/孔接种于96孔板，于37 ℃、5%CO2培养长满单层后，吸弃培养液，每孔接种病毒液100 TCID 50/孔，于37 ℃吸附1 h，吸弃病毒液，再加入不同浓度的夏枯草多糖溶液(200、100、50、25、12.5 μg/mL)，每浓度3个复孔，每孔200 μL，同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物对照组(ACV：4、2、1、0.5、0.25 μM)。于37 ℃、5%CO2培养72 h，每天观察CPE，并记录；显微镜下观察细胞病变程度(CPE)，以确定药物对病毒的抑制作用，记录方式：0%细胞病变为“-”，<25%细胞病变为“+”，25%～50%细胞病变为“++”，50%～75%细胞病变为“+++”，>75%细胞病变为“++++”，以出现“-”的最小浓度为抗病毒活性最佳。培养72 h后，吸去培养液，加入新的培养液，再加入MTT，培养4 h，加入DMSO，在570/650 nm波长下测定吸光度，计算IC50值。存活率=(药物组-病毒感染组)/(细胞组-病毒感染组)×100%，通过Spss软件计算夏枯草多糖提取物对HSV-1和HSV-2抑制作用的IC50。SI=CC50/IC50，治疗指数(SI)越大，抗病毒活性越好。

由表13和表14结果表明，通过MTT法筛选，醇沉工艺和超滤工艺都具有抗疱疹I型病毒活性呈差异(P<0.05)，且超滤技术制备的样品抗单纯性疱疹病毒活性优于醇沉工艺。

图2　50%醇沉和50KDa超滤多糖提取物CPE图(HSV-1)

由图2结果表明，50%醇沉和50KDa超滤多糖提取物随着浓度增加，抑制病毒活性也增加，通过MTT/CPE法实验观察，发现超滤工艺提取物的抑制疱疹病毒作用优于醇沉工艺提取物。

3　讨论

多糖的含量测定方法常采用比色法，分别为蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和咔唑-硫酸法。蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法是用于测定多糖含量最为广泛的分析方法，其原理为糖类物质在强酸性条件下水解成单糖分子，并迅速脱水生成糠醛或其衍生物，再与酚类或胺类化合物缩合形成有特殊颜色的物质，该物质在紫外区有特征吸收，且吸收值在一定范围内与糖质量浓度呈线性关系。在选择测定方法时，考虑到蒽酮-硫酸法能测定溶液中全部可溶性碳水化合物的总量，并且蒽酮-硫酸法标准曲线的线性、稳定性和重现性均优于苯酚-硫酸法，所以本实验选择蒽酮-硫酸法测定夏枯草多糖[7]。

本实验通过正交设计优选夏枯草的水提取工

艺，以夏枯草多糖含量和浸膏得率为考察指标，采用综合评分的方法确定最佳提取工艺为：药材第一次加14倍量水，第二、三次加12倍量水，提取3次，每次回流1.5 h。按最佳工艺进行重复性实验，结果表明稳定性较理想，该方案节约能耗，成本低，适合于产业化生产，故此方案合理可行。

本实验比较了膜分离超滤技术与传统醇沉工艺对夏枯草活性部位的制备，结果显示，用超滤技术制备的夏枯草样品，多糖纯度和抗单纯性疱疹病毒活性均优于传统的醇沉工艺。二者的纯化原理不同，超滤是一种膜分离技术，其工作原理是以选择性透过膜为分离递质，在外界压力作用下，原料组分选择性地透过膜，以达到分离、提纯的目的，自20世纪80年代初起被应用于中药的纯化工艺中。醇沉工艺是根据相似相溶的原理，使不溶于乙醇的成分溶解度下降沉淀的过程。超滤作为新兴的高效膜分离技术，具有分离精度高、成本低、环保、操作简单等特点，与传统的水提醇沉纯化多糖相比较，超滤法显示出其独特的优势，正被越来越多的中药研究者加以应用，提示可作为夏枯草开发成抗单纯性疱疹病毒新药有效部位的纯化工艺。

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(2016-07-05收稿责任编辑：洪志强)

Extraction and Purification of Anti-HSV Polysaccharides from Prunella Vulgaris

Kong Siyuan1,2，Wu Rong1,2，Cai Shuangfan1,2，Tan Hongsheng1,2

(1SchoolofPharmacy，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China；2EngineeringResearchCenterofShanghaiCollegesforTCMNewDrugDiscovery，Shanghai201203，China)

Objective:The aim of this study is to optimize the extraction and purification process for anti-HSV polysaccharides from Prunella Vulgaris.Methods:The extraction method was modified by an orthogonal array experiment on three variable parameters：extraction time，solvent volume and extraction times.The content of polysaccharides and extraction yield were used as index.The effects of ultrafiltration technology and alcohol precipitation were compared in the purity of polysaccharide and anti-HSV activity.Results:The optimized extraction parameters are three extractions，1.5 hour extraction time，14 times of water for the first extraction and 12 times of water for the second and third extraction.The polysaccharide obtained from ultrafiltration technology and alcohol precipitation showed anti-HSV-1 activity in MTT assay，with IC50values of(93.99 ± 13.12)μg/mL and(51.35 ± 15.30)μg/mL，respectively.The results suggested that the two purification processes have significantly different degrees of polysaccharide purity.The anti-HSV activity of polysaccharide from ultrafiltration technology was significantly higher than that of alcohol precipitation.Conclusion:The polysaccharides from Prunella Vulgaris obtained using ultrafiltration technology have higher anti-HSV activity than that isolated by alcohol precipitation.

Prunella Vulgaris L.; Anti-HSV; Polysaccharides; Extraction; Purification; Alcohol precipitation; Ultrafiltration

“重大新药创制”科技重大专项“十二五”计划(编号：2013ZX09103002-020)

孔思远(1991.02—)，男，硕士研究生，研究方向：中药活性成分研究，E-mail：602552484@qq.com

谭红胜(1977.05—)，女，博士，副研究员，研究方向：中药活性成分研究及中药新药研发，E-mail：ths97029@163.com

R285.0

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.002