王凤玲　金　茜　于　盈　毛娟娟　侯　伟　陈永平.浙江省台州市立医院感染科，浙江台州　38000；.温州医科大学附属第一医院感染科，浙江温州　35000

大黄素联合骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭

王凤玲1金茜1于盈1毛娟娟1侯伟1陈永平2
1.浙江省台州市立医院感染科，浙江台州318000；2.温州医科大学附属第一医院感染科，浙江温州325000

目的探讨大黄素联合骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠的治疗作用。 方法选择SD大鼠51只，随机分4组：健康对照组6只，急性肝衰竭（ALF）模型组15只，骨髓间充质干细胞（BMSCs）组15只，大黄素联合骨髓间充质干细胞（EMD+BMSCs）组15只。D-氨基半乳糖（D-GalN）诱导大鼠急性肝衰竭模型；BMSCs组及EMD+ BMSCs组于造模后12 h尾静脉注射BMSCs悬液1.5 mL（约含BMSCs1.0×106cells/mL），共1次；EMD+BMSCs组于造模后12 h开始腹腔注射大黄素10 mg/kg，每天2次，共3 d。ALF模型组于造模后12 h尾静脉注射等体积无菌PBS。各组大鼠均在造模后72 h，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取门静脉血及肝组织标本。测血清ALT、AST、TBil，免疫组化测肝组织Bcl-2、Bax及PCNA蛋白表达。结果造模后72 h，ALF模型组大鼠血清ALT、AST 和TBil指标显著升高，与健康对照组相比，差异有统计学意义（t=7.191、6.796、6.835，P均＜0.05）。与ALF模型组比较，BMSCs组及EMD+BMSCs组血清ALT、AST、TBil均有不同程度下降，以EMD+BMSCs组为著。EMD+BMSCs组中Bcl-2、PCNA表达明显高于健康对照组及ALF模型组，而Bax表达则显著低于ALF模型组，差异有统计学意义（t=5.557，P＜0.05）。 结论大黄素联合骨髓间充质干细胞治疗对急性肝衰竭大鼠肝功能的改善及促进肝细胞再生作用更佳，此种作用可能部分与Bcl-2/Bax的调节有关。

大黄素；骨髓间充质干细胞；肝功能衰竭；Bcl-2；Bax；

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是多种病因引起的一种肝功能急剧丧失的临床重症。其治疗的关键在于减少肝细胞坏死和刺激肝细胞再生。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种来源广泛、免疫原性低、具有多向分化潜能的成体干细胞［1］，因其强大的可塑性，且能在体外分化为包括肝细胞在内的多种成体细胞，有望成为各种组织损伤或器官衰竭的替代疗法［2-4］。既往研究表明，BMSCs对肝硬化及肝衰竭有一定的治疗作用［5，6］。大黄素（emodin，EMD）为大黄的一种主要有效成分，具有抑制肿瘤、抗炎、免疫调节、肝保护等作用［7-9］。本实验拟建立大鼠急性肝衰竭模型，尾静脉注射骨髓间充质干细胞，同时腹腔注射大黄素，观察两者联合治疗对急性肝衰竭大鼠的影响及相关机制。

1　资料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠共51只，重200 g左右，由温州医科大学实验动物中心提供［许可证号：SYYK（浙）2010-0150］。

1.1.2仪器和试剂全自动生化分析仪、D-氨基半乳糖（D-GalN）、大黄素分别由日本日立公司、重庆医科大学化学教研室、苏州宝泽堂医药科技有限公司提供。胎牛血清、低糖DMEM购自Hyclone公司。Percoll分离液、免疫组化试剂盒分别购自美国Sigma公司和北京中杉金桥生物技术有限公司。Bcl-2、Bax、PCNA一抗购自美国Santa Cruze公司。

1.2方法

1.2.1动物分组 按照随机数字表法分为四组：健康对照组、急性肝衰竭（ALF）模型组、骨髓间充质干细胞（BMSCs）组、大黄素联合骨髓间充质干细（EMD+BMSCs）组。健康对照组6只，其余各组每组15只，各组大鼠均在造模后72 h，采集肝组织标本和肝门静脉血。各组大鼠均予正常饮食，术前禁饮4 h，禁食12 h。

1.2.2BMSCs分离培养 无菌条件下分离SD大鼠股骨，去除软组织。在无菌操作台取出完整股骨和胫骨，切除股骨和胫骨两端，DMEM（低糖）培养基冲出骨髓，轻轻混匀，使充分散开。采用Percoll（密度为1.073）梯度离心方法（2500 rmp，25 min），用滴管小心取得中间絮状层，DMEM洗涤2次（1000 rmp，5 min），含10%胎牛血清的培养基中培养，1 d后予以首次半量换液，然后每隔3 d换新鲜的DMEM液。于细胞铺满瓶底近80%时，予以传代。在传至第3代时，完全去除非贴壁的球形骨髓造血细胞，得到纯化的BMSCs。然后每次均于细胞接近80%铺满瓶底时再传代，细胞浓度为1.0×106/mL时移植。

1.2.3动物处理 健康对照组腹腔注射生理盐水，其余各组大鼠给予10%D-GalN 1.25 g/kg腹腔注射1次。BMSCs组及EMD+BMSCs组于造模后12 h尾静脉注射BMSCs悬液 1.5 mL（约含BMSCs1.0×106/mL），共1次；EMD+BMSCs组于造模后12 h开始腹腔注射大黄素10 mg/kg，每天两次，共3 d。ALF模型组于造模后12 h尾静脉注射等体积无菌PBS。各组大鼠均在造模后72 h，用水合氯醛（质量分数为0.1）腹腔注射麻醉，在无菌条件下收取3～5 mL门静脉血，获取离心后的上清液，放-80℃冰箱保存；另留取大鼠肝组织，予甲醛（体积分数为0.04）固定。

1.2.4测定肝脏功能 采集的门静脉血清标本，用日本日立公司提供的全自动生化分析仪（型号7600-010）检测丙氨酸转氨酶（alanine animotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate animotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBil）和血白蛋白（albumin，Alb）。1.2.5肝组织标本HE染色 取肝组织，予以石蜡包埋，切片4 μm，苏木精-伊红染色，置光学显微镜下观察。1.2.6肝组织Bcl-2、Bax及PCNA蛋白检测石蜡切片脱蜡复水，3%过氧化氢室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡，5%～10%正常山羊血清封闭。滴加一抗，4℃过夜。PBS冲洗，滴加适量生物素标记工作液、碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，每次滴加后均予37℃孵育10～30 min，PBS冲洗，然后显色剂显色、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。阴性对照中以PBS代替一抗，免疫组化染色，阳性细胞表现为细胞质和/或细胞核呈棕黄色。经Image-ProPlus 6.0图像分析系统测定肝组织平均光密度OD值［积分光密度（IOD SUM）/组织面积（Area SUM）］，代表蛋白表达水平。

1.3统计学处理

用SPSS16.0统计学软件进行处理，计量资料采用均数±标准差表示，计量资料多组间比较用单因素方差分析，Levene法检验方差齐性，方差齐时多样本均数之间两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清ALT、AST、TBil和Alb的数值

数据经方差齐性检验后，各组同一指标数据之间的方差具有齐性（F=118.73、124.28、84.35和73.33，P均＜0.05），故各组间两两比较用LSD检验。ALF模型组大鼠血清ALT、AST和TBil在造模后72 h均有升高，与健康对照组比较，差异有统计学意义（P= 0.009、0.004、0.021，P均＜0.05）；BMSCs组血清 ALT、AST和TBil较ALF模型组有所下降（P=0.012、0.011和0.027，P均＜0.05），而EMD+BMSCs组较ALF模型组下降更为显著（P=0.001、0.000和0.003，P均＜0.01），EMD+BMSCs组较BMSCs组对ALT及AST的改善作用更加（P=0.032和0.021，P均＜0.05）；ALF模型组Alb较健康对照组明显下降（P=0.028，P＜0.05），BMSCs组及EMD+BMSCs组高于ALF组（P=0.043、0.036，均P＜0.05），而BMSCs组与EMD+BMSCs组无明显差异（P=0.253，P＞0.05），见表1。

表1　各组大鼠血清ALT、AST和TBil水平变化（）

表1　各组大鼠血清ALT、AST和TBil水平变化（）

注：ALT：丙氨酸转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶；TBil：总胆红素；Alb：血白蛋白。各组与健康对照组相比，aP＜0.05；BMSCs组、EMD+BMSCs组与ALF模型组相比，bP＜0.01，cP＜0.05；EMD+BMSCs组与BMSCs组相比，dP＜0.05，eP＞0.05

组别　n　ALT （U/L）AST （U/L）TBil （μmol/L）Alb （g/L）健康对照组ALF模型组BMSCs组EMD+BMSCs组F值P值6 15 15 15 24.5±3.2 1206.3±193.7a528.0±77.4ac296.7±34.4abd118.73 0.016 49.6±9.1 1537.2±159.3a716.7±154.7ac468.4±50.8abd124.28 0.062 7.1±2.3 31.6±6.2a9.6±9.1c7.6±3.1be84.35 0.027 38.6±5.2 29.9±6.4a32±7.2c33±5.8ce73.33 0.011

2.2肝组织病理学改变

健康对照组大鼠肝脏肝小叶结构完整，ALF模型造模后72 h，肝小叶结构破坏明显，肝索结构紊乱，可见大片坏死肝细胞。表明已成功建立急性肝衰竭模型。见图1、2。

图1　正常大鼠肝组织（苏木素-伊红染色，×400）

图2　ALF大鼠肝组织（苏木素-伊红染色，×400）

2.3免疫组化法检测肝脏Bcl-2、Bax及PCNA蛋白的表达

Bcl-2、Bax及PCNA数据经方差齐性检验后，各组之间的方差具有齐性（F=115.75、132.72和66.87，P均＜0.05），故各组间两两比较用LSD检验。ALF模型组肝组织Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达升高，与健康对照组比较差异显著（P=0.029、0.014，P均＜0.05）；与ALF模型组比较，BMSCs组与EMD+BMSCs 组Bcl-2蛋白表达显著增加（P=0.005、0.000，P均＜0.01），Bax蛋白表达下降 （P=0.031、0.025，P均＜0.05）；BMSCs组与EMD+BMSCs组Bcl-2、Bax蛋白表达无统计学差异。Bcl-2、Bax蛋白在肝组织内表达见表2。正常组PCNA蛋白表达很少，ALF模型组肝组织PCNA表达较正常组升高 （P=0.035，P＜0.05），BMSCs组及EMD+ BMSCs组较ALF模型组变化差异均有统计学意义（P=0.026、0.005，P均＜0.05）。见表2、3。

表2　各组大鼠肝组织Bcl-2和Bax水平变化（）

表2　各组大鼠肝组织Bcl-2和Bax水平变化（）

注：各组与健康对照组相比，aP＜0.01，bP＜0.05；各治疗组与ALF模型组相比，cP＜0.01，dP＜0.05；EMD+BMSCs组与BMSCs组相比，eP＞0.05

组别　n　Bcl-2　Bax健康对照组ALF模型组BMSCs组EMD+BMSCs组F值P 6 15 15 15 0.084±0.007 0.047±0.003b0.195±0.012ac0.211±0.014ace115.75 0.031 0.071±0.007 0.119±0.025b0.084±0.014d0.079±0.011de132.72 0.023

表3　各组大鼠肝组织PCNA水平变化（）

表3　各组大鼠肝组织PCNA水平变化（）

注：PCNA：增殖细胞核抗原。各组与健康对照组相比，aP＜0.01，bP＜0.05；各治疗组与ALF模型组相比，cP＜0.01，dP＜0.05；EMD+BMSCs组与BMSCs组相比，eP＜0.05

组别　n　PCNA健康对照组ALF模型组BMSCs组EMD+BMSCs组F值P 6 15 15 15 0.054±0.007 0.101±0.032b0.155±0.031ad0.197±0.043ace66.87 0.045

3　讨论

急性肝衰竭（ALF）是由多种因素所引起的一种严重肝脏损害，临床以凝血机制异常、黄疸、肝性脑病和腹水等为主要表现，病程进展快、病死率高、预后差，其治疗仍是世界性难题［10］。原位肝移植是最根本的治疗方法，但因供体缺乏、手术风险高、高额的医疗费用以及移植排斥反应，极大限制了肝移植的临床应用［11］。近年来细胞移植开始作为肝移植的辅助或替代疗法，成为治疗肝衰竭研究的热点［12］。BMSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，BMSCs不但能分化为软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等，还能在肝脏微环境中分化为胆管细胞和肝细胞，帮助修复损伤的肝细胞，最终达到改善肝功能的目的［13-15］，使干细胞移植成为急性肝衰竭治疗新的手段。

本研究表明，BMSCs移植后，急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST及TBil较ALF模型组下降，说明BMSCs对急性肝衰竭大鼠肝功能具有保护作用。BMSCs可能分化形成正常肝细胞，补充肝细胞数量，改善肝功能，或者分泌多种细胞因子和生长因子，以抑制炎症反应，促进细胞再生。本实验中将BMSCs经尾静脉注射，其迁移并定位至肝脏需要一定的时间，本实验只观察72 h，故BMSCs通过分化成正常肝细胞，补充肝细胞数量而改善肝功能可能性不大，考虑肝功能的改善作用可能与BMSCs迁移至肝脏时，首先通过分泌细胞因子及生长因子，从而刺激和修复损伤的肝细胞有关［16］。

增殖细胞核抗原（PCNA）的合成与细胞的增殖有着密切的关系，其含量的多少直接反映细胞的增殖活性，是评价肝脏细胞再生的重要指标。既往研究表明，大黄素可以增加急性肝衰竭大鼠肝组织PCNA的表达，促进肝细胞的再生［17］。本实验中各治疗组肝组织PCNA表达较ALF模型组明显增加，而EMD+BMSCs组促进肝细胞的再生作用最强，表明EMD+BMSCs联合治疗的优势。

大黄素可以抑制内毒素诱导的巨噬细胞激活，减少核因子-κb、肿瘤坏死因子-α、白介素-10等致炎因子的释放。通过抑制免疫细胞激活及细胞因子释放而发挥抗炎作用。减少损伤肝组织的Kupffer细胞、淋巴细胞的浸润，减轻肝细胞坏死，保护肝细胞。本实验以D-GalN诱导大鼠急性肝衰竭模型，发现BMSCs移植后，可以降低急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST及TBil水平，而EMD+BMSCs组效果更佳，推测可能与大黄素减少内毒素吸收入血，减轻内毒素血症有关［18］。同时大黄素能抑制由内毒素诱导的TNF-α等相关炎症因子的分泌，减轻肝脏炎症反应［19］。

Bcl-2家族是近年来研究较多的细胞凋亡调控基因，许多研究显示肝细胞是否发生凋亡受Bcl-2家族的调控。Bcl-2的上调可通过抑制肝细胞凋亡而减轻肝细胞的纤维化程度［20］。而Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白。大黄素能抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2）和促进促凋亡蛋白（Bax）的表达，增加细胞凋亡［21］。而BMSCs能促进人肺泡上皮细胞Bcl-2表达，抑制Bax表达，减少细胞凋亡［22］。本研究中，ALF模型组肝组织内Bcl-2表达较健康对照组减少，Bax表达增加，说明肝细胞凋亡增加；与ALF模型组比较，BMSCs组及EMD+BMSCs组肝组织Bcl-2蛋白表达明显增加，Bax蛋白表达下降，EMD+BMSCs组Bcl-2与Bax蛋白表达与BMSCs组比较差异无统计学意义。说明联合治疗中大黄素并没有抵消BMSCs的抗凋亡作用，而是具有协同作用，更好地保护肝细胞。

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Combined therapy of emodin and bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for rat model of acute liver failure

WANG Fengling1JIN Qian1YU Ying1MAO Juanjuan1HOU Wei1CHEN Yongping2
1.Department of Infection and Liver Disease，Taizhou Municipal Hospital，Taizhou318000，China；2.Department of Infection and Liver Disease，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China

Objective To evaluate synergic effects of emodin combined with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation in liver injury following acute liver failure（ALF）in rats.Methods 51 SD rats were divided into four groups.There were six rats in normal group and forty five in model group of ALF.The model of ALF（including ALF group，BMSCs group，EMD+BMSCs group，with each of 15 rats）was induced in rats by D-galactosamine（D-GalN）successfully.Rats in BMSCs group&EMD+BMSCs group were treated with injection of 1.5 mL of suspension liquid of BMSCs（including BMSCs 1.0×106/mL）via caudal vein 12 h after model establishment.The sera and hepatic tissue samples were collected at 72 h after D-GalN injection.The sera were used for detecting ALT，AST and TBil.Bcl-2 and Bax in hepatic tissue samples were detected by S-P immunohistochemical staining.Results The levels of ALT，AST and TBil in model group of ALF at 72 h were significantly higher than those in normal group，and the levels of ALT，AST and TBil in every treated group were significantly reduced，especially in group EMD+BMSCs.The levels of Bcl-2 and PCNA in group EMD+BMSCs were significantly higher than those in normal and model group.The levels of Bax in group EMD+BMSCs were lower than model group.Conclusion EMD combined BMSCs are more effective to protect rats against acute liver failure，which is partly by means of down-regulating Bax expression and up-regulating Bcl-2 expression in liver tissue.

Emodin；BMSCs；Liver failure；Bcl-2；Bax

R575.3

A

1673-9701（2016）14-0023-04

浙江省中医药科学研究基金计划（2010ZA118）；浙江省台州市椒江区科技计划项目（112070）