张晓晴 闵钟熳

摘要：以自主分离的益生性地衣芽孢杆菌LB8为研究对象，通过单因素和正交试验对其发酵条件进行优化，得到该菌株培养的最适条件为：培养时间20 h，葡萄糖2%，豆粕粉1.5%，硫酸镁0.025﹪，NaCl为0.6%。

关键词：地衣芽孢杆菌；发酵条件；优化；正交试验

中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）05-0045-04

微生物发酵受很多环境条件影响，除受pH、温度、接种量影响外，还受培养基碳氮源、微量元素等影响。良好的外界环境不但有利于菌体生长，而且可提高微生物对底物的利用能力。培养基和培养条件优化就是选择一组培养条件使菌株的生长潜力得到最大程度发挥。这样不但可以降低成本、提高产率，而且可以促进动物微生态制剂商品化生产。针对培养基和培养条件对地衣芽孢杆菌LB8的发酵培养进行优化，确定适合芽孢杆菌的培养基成分和培养条件，提高益生菌产量，为工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 地衣芽孢杆菌LB8（Bacillus licheniformis LB8）：自主分离自动物肠道。

1.1.2 试剂与药品 95%乙醇、盐酸、蔗糖、MgSO4、NaCl、可溶性淀粉、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、胰蛋白胨、（NH4）2SO4、豆粕粉

1.1.3 培养基 种子培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；液体基础培养基：蔗糖1.5 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5g，蒸馏水100 mL，pH 7.5。

1.1.4 主要仪器及设备 DK-S26型恒温水浴锅：上海精宏医疗器械厂；DL-CJ-1F超净工作台：东联哈尔滨仪器制造有限公司；LDZX-40SAI型高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SL1-700电热恒温培养箱：湖北黄石医疗仪器制造厂；BSA124S-CW电子分析天平：上海赛多利斯仪器系统有限公司；SHA-C恒温振荡摇床：常州国华电器有限公司；KA-1000低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 采用单因素试验对地衣芽孢杆菌LB8发酵所需要的各项条件进行单项优化。

种龄的确定：用接种环从培养好的斜面培养基中挑取1环，接种于盛有30 mL种子培养基的三角瓶中，置于32 ℃、180 r/min条件下振荡培养12 h。然后，按5%接种量将其转接到300 mL液体基础培养基中，在同样条件下摇床振荡培养，连续测定48 h。每4 h取样一次，平板菌落计数并记录。

碳源的确定：将液体基础培养基中的蔗糖分别用等量的乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖（对照）代替，5﹪接种菌种后测定活菌量，于32 ℃、180 r/min条件下培养20 h，确定最佳碳源。

氮源的确定：将基础培养基中的蛋白胨分别用等量的编号为①、②、③、④的胰蛋白胨（1.0 g）+酵母粉（0.5g）、豆粕粉、（NH4）2SO4、蛋白胨（对照）代替，以5%接种后，于32℃、180 r/min条件下培养20 h，测定活菌量，确定最佳氮源。

MgSO4对液体发酵的影响：在基础培养基中分别添加浓度为0，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%的MgSO4，接种菌株培养后测定菌体生物量，研究MgSO4对LB8菌体活菌量的影响。

NaCl对液体发酵的影响：在基础培养基中分别添加0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的NaCl进行试验，培养后测定菌数，研究NaCl对LB8的活菌量的影响。

1.2.2 培养基成分正交试验设计 在上述试验结果的基础上，选用正交表优化培养基。将LB8菌悬液接入不同培养基中，在相同条件下培养后测定菌体生物量，并对数据进行分析，确定适合LB8生长的最佳培养基。L9（34）因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 液体培养条件优化

2.1.1 种龄的确定 采用活菌计数法测定LB8不同时间的活菌数，以活菌数作为纵坐标，时间为横坐标，绘作菌体的生长曲线图，见图1。

由图1可知：0～4 h为菌株延迟期，在这段时间，菌体很快得到复苏；菌体在4～5 h后进入对数生长期，数量明显增加，当培养时间达20 h时，菌体进入稳定期。因此该菌株最佳培养时间应为20 h。

2.2.2 最佳碳源的确定 如图2所示，LB8以葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉为碳源时，菌体生物量较低，而以葡萄糖为碳源时菌量较大，菌数为4.5×109 CFU/mL。因此，葡萄糖可作为最适碳源。

2.2.2 最佳氮源的确定 由图3可看出，LB8在不同氮源中的生长情况呈现较大差异，以豆粕粉为氮源时菌种生物量最大，菌量可达3.8×109 CFU/mL。所以宜选用豆粕粉为氮源。

2.2.3 MgSO4对液体发酵的影响 镁离子作为多种酶的激活剂，对生物新陈代谢有很显著的影响，对菌体的生长也不例外，结果如图4所示。

由图4可知：Mg2+浓度在0.02%时菌量达到最大，随着Mg2+浓度的进一步增高，菌体数量呈下降趋势。 2.2.4 NaCl浓度对液体发酵的培养 将菌种接种到不同浓度的NaCl培养基中，结果如图5所示。

由图5可知：NaCl浓度在0.5%时，菌量最大，为5×109 CFU/ml；随着浓度的增加，菌量下降，说明过高的NaCl浓度不利于菌体生长，适量的NaCl浓度对菌体生长繁殖有促进作用。

2.2.5 培养基成分正交试验分析 培养基成分正交试验结果见表2。

从表2可知：各试验因素水平对LB8的生长有不同影响，四因素对LB8培养影响的显著性次序为A>B>D>C，即碳源浓度对菌数的影响最显著，氮源浓度次之，硫酸镁影响最小。在所选因素水平下，4种因素的最佳组合应为A3B3C2D3，即葡萄糖2%，豆粕粉为1.5%，MgSO4为0.025%，NaCl为0.6%。

3 结论与讨论

地衣芽孢杆菌LB8是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌株之一。体外试验证明，地衣芽孢杆菌对致病菌有很强的拮抗作用，能够替代抗菌素起防病抗病作用。它能在肠道中产生大量的消化酶（如淀粉酶、蛋白酶、植酸酶等）和维生素（B族维生素，维生素K等），具有很强的抗消化道生境及较好的益生性。它还能增强机体特异性和非特异性免疫反应，促进巨噬细胞的吞噬活性，从而大大提高动物的抗感染能力。目前，微生态制剂调控技术已经成为解决养殖水域污染病害问题的有效手段之一。地衣芽孢杆菌LB8具有较好饲料蛋白质和淀粉降解能力，在动物养殖上具有潜在应用价值。

目前，地衣芽孢杆菌的生产工艺较为成熟，但在饲料生产和环境污染治理等方面仅处在起步阶段。在人们越来越关注食品安全、迫切希望减少抗生素使用的今天，地衣芽孢杆菌作为新一代饲料添加剂必将得到进一步研究与应用。因此，开展地衣芽孢杆菌制剂的研究和开发有广阔的市场前景。

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Abstract： In this research the separate prebiotics Bacillus licheniformis LB8 taken as the research object， single factor and orthogonal test used to optimize the fermentation conditions， the optimum condition for the bacterial strain culture was obtained： the culture time 20 h， glucose 2%， soya been meal 1.5%， magnesium sulfate 0.025%， and NaCl 0.6%.

Key words： Bacillus licheniformi； fermentation conditions； optimize； orthogonal test