闫敏，闫华林，李明

(1.解放军第一O五医院检验科，安徽 合肥　230031；2.安庆市第一人民医院检验科，安徽 安庆　246004)



几种不同方法学检测胃蛋白酶原I，II临床应用探讨

闫敏1，闫华林2，李明2

(1.解放军第一O五医院检验科，安徽 合肥230031；2.安庆市第一人民医院检验科，安徽 安庆246004)

摘要：目的使用化学发光法(CLIA)，流式荧光发光法(FFIA)，酶联免疫法(ELISA)三种不同的方法检测血清胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)，探讨三种检测方法用于胃癌辅助诊断的临床价值。方法通过方法学比对与相关分析，比较三种方法的一致性与相关性。通过检测确诊为胃癌患者的临床血清样本，利用ROC曲线确定PGI与PGI/PGII(PGR)临界值，评价三种方法的灵敏度与特异度。结果三种方法测试不同组别血清样本中PGI、PGII，根据PGI、PGII结果计算PGR。发现胃癌组与非胃癌组间PGI、PGR两个指标差异有统计学意义，PGII差异无统计学意义。方法学比对发现，不同方法学之间PGI、PGII相关性良好，相关系数r为：0.9612～0.9789，不同方法学之间PGR相关系数为：0.8602～0.9109。对三种方法进行ROC曲线分析，确定ROC曲线最佳临界值后，分析PGI、PGR组合用于胃癌诊断，化学发光法、流式荧光发光法、酶联免疫法灵敏度分别为67.6%，61.8%，58.8%，特异度分别为96.6%、94.7%、96.6%。结论化学发光法，流式荧光发光，酶联免疫法检测PGI、PGII存在较好的相关性。通过临床评估，PGI结合PGR可以有效提高胃癌的诊断特异度与阳性预测值，具有较好的临床价值。

关键词：胃蛋白酶原A;胃蛋白酶原C;发光测定法;流式细胞术;聚合酶链反应

胃癌在全国居恶性肿瘤发病第2位，发病率为36.21/106[1]，是我国最常见恶性肿瘤之一。早期胃癌术后生存率可以达到80%以上，但目前缺乏简便的早期筛查的方法，近年来利用肿瘤标志物用于胃癌辅助诊断或早期筛查研究较多，其中利用胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)用于胃癌辅助诊断有较为明显的优势[2～4]，PG为由375个氨基酸组成的胃蛋白酶的无活性前体，相对分子量为42kD，Samloff根据其生化性质和免疫原性将其分成PGI与PGII2个亚群，PGI主要由胃黏膜细胞及颈黏液细胞分泌；PGII主要由全胃腺体及十二指肠Brunner腺分泌[5]。检测胃蛋白酶原I、II常用方法有：酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法(CLIA)、流式荧光发光法(FFIA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、光激化学发光免疫分析法(LICA)以及乳胶增强免疫比浊法等[6-9]。本次研究利用化学发光法、酶联免疫吸附法、流式荧光发光法三种不同方法检测血清PGI、PGII，评价了三种方法的一致性与相关性，并通过临床样本评价了三种不同方法各自灵敏度与特异度。

1　材料和方法

1.1主要试剂及仪器胃蛋白酶原Ⅰ∕胃蛋白酶原Ⅱ联合定量测定试剂盒(流式荧光发光法)由上海透景公司提供，配套使用仪器为Luminex多功能流式点阵仪(Luminex公司，型号Luminex200)；胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II检测试剂盒(酶联免疫法)由芬兰Biohit公司提供，配套使用仪器为酶标仪(郑州安图，型号：PHOMO)；胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)由Abbott公司提供，配套仪器为Abbott全自动免疫分析仪(Abbott公司，型号：ARCHITECTi2000SR)。

1.2标本来源2015年1月至2015年7月期间，安庆市第一人民医院消化内科共收集临床血清样本241例。其中通过胃镜及病理组织确诊为胃癌的样本为34例(平均年龄55岁，男性17例，女性17例)，该组作为胃癌组；胃部良性疾病38例(含慢性胃炎32例、胃溃疡组5例、胃部良性息肉1例；平均年龄58岁，男性26例，女性12例)，该组作为胃部良性疾病组；另外再取经体检无胃部疾病的健康体检样本169例(平均年龄40岁，男性73例，女性96例)，作为健康对照组。在分析PGI、PGII用于胃癌辅助诊断时，胃部良性疾病组与健康对照组合并成非胃癌组。

1.3方法采集受试者空腹静脉血5mL，离心分离血清后置-20℃保存待测。检测过程中严格按照三个不同方法学试剂说明书及仪器说明书要求进行操作，在测试过程均进行质控，上海透景试剂采用上海透景提供的质控品，芬兰Biohit试剂使用试剂盒内配套质控品，Abbott试剂盒Abbott公司提供的PGI，PGII质控品，要求质控品测值均应在其提供的参考范围内。

1.4统计学方法用MicrosoftExcel2010与IBMSPSS22进行图形处理与数据统计分析。使用对于正态分布计量数据两组间比较用独立样本t检验；多组间比较用方差分析；两两比较采用SNK-q检验方法。对偏态分布计量数据，两组间比较用Mann-WhitneyU检验；多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。通过方法学比对比较三种方法测值的一致性，对不同方法学间进行相关分析。使用SPSS分析PGI、PGII以及PGR对胃癌诊断的ROC曲线，分析ROC曲线面积，并通过ROC曲线确定各个指标最佳临界值，通过确定的临界值分析三种方法各自灵敏度，特异度，阳性预测值以及阴性预测值。所有检验均以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三种方法检测不同组别样本结果分析经三种不同方法对PGI、PGII以及PGR检测结果统计见表1。

2.2三种方法学检测结果分析对三种方法测试得到的PGI、PGII及PGR结果进行两两方法学比对，绘制散点图，并拟合两方法学之间的直线方程(图1)，分析方法学间相关性(表1)。

表1　三种不同方法检测结果统计分析

注：同方法学内与胃癌对照组比较，aP<0.05，同方法学内与胃部良性疾病组比较，bP<0.05。

注：图(a)，化学发光法与流式荧光发光法PGI方法学比对散点图；图(b)，化学发光法与酶联免疫法PGI方法学比对散点图；图(c)，流式荧光发光法与酶联免疫法PGI方法学比对散点图；图(d)，化学发光法与流式荧光发光法PGII方法学比对散点图；图(e)，化学发光法与酶联免疫法PGII方法学比对散点图；图(f)，流式荧光发光法与酶联免疫法PGII方法学比对散点图；图(g)，化学发光法与流式荧光发光法PGR方法学比对散点图；图(h)，化学发光法与酶联免疫法PGR方法学比对散点图；图(i)，流式荧光发光法与酶联免疫法PGR方法学比对散点图。

图1　三种不同方法学检测PG，PGI、PGII、PGR三个指标不同方法学比较 表2　不同方法学间相关系数r统计

2.3ROC曲线分析及最佳临界值确定以胃癌组作为阳性组，胃部良性疾病组与健康对照组作为阴性组。因PGII指标在三个组别间测值差异无统计学意义，仅绘制PGI、PGR在三个方法学中各自的ROC曲线，见图2，并计算出各曲线下面积见表3。选择ROC曲线上靠近左上方即约登指数最大的切点为最佳临界值，分别计算出各个指标在不同方法学下最佳临界值，见表3。

图2　PGI、PGR在各自方法学中ROC曲线表3　不同方法学下不同指标ROC曲线

指标ROC曲线下面积P值95%置信区间最佳临界值化学发光法PGI0.8060.0000.718～0.89447.20化学发光法PGR0.8350.0000.744～0.9272.83流式荧光发光法PGI0.7930.0000.707～0.87855.85流式荧光发光法PGR0.8330.0000.741～0.9255.75酶联免疫法PGI0.7970.0000.708～0.88648.81酶联免疫法PGR0.8300.0000.735～0.9265.15

2.4不同方法学PG灵敏度与特异度分析通过ROC曲线确定最佳临床诊断值，其中先分析PGI单指标灵敏度与特异度数据，见表4。再利用PGI与PGR指标串联方式进行检验结果判断(即PGI、PGR同时为阳性才判断检验结果为阳性，否则为阴性)。对241例样本结果进行分析统计，计算各个方法学对胃癌的诊断灵敏度与特异度，并计算各自阳性预测值与阴性预测值，见表5。

表4　三种不同方法检测PG各自诊断灵敏度与特异度(使用PGI单指标)/%

表5　三种不同方法检测PG各自诊断灵敏度与特异度(使用PGI、PGR组合指标)/%

3　讨论

血清中胃蛋白酶原PG水平可以反映胃黏膜功能和组织学状况，PG作为胃癌的肿瘤标志物现已经获得广泛研究与临床应用。相对单独进行PGI检测，PGI结合PGR，可以有效提高诊断特异度[9]。

目前有相当多的检测PG的方法，不同的方法有可能导致样本测试结果产生较大差异[7]。本次研究采用了3种方法来检测同一批临床血清样本中PGI、PGII，分析三种不同方法学之间的一致性与相关性，其中流式荧光发光法是较为创新的方法，可以一次测试实现PGI、PGII两个指标的同步测试。对三种不同方法检测PGI、PGII进行两两方法学比对，相关系数r为0.961 2～0.978 9，提示三种不同方法学之间存在良好的相关性，PGR两两相关系数r为0.860 2～0.910 9。从图形及数据来看，PGR方法学之间相关性明显不及PGI、PGII。主要原因可能为不同方法学因采用抗体的差异以及方法学本身差异，导致同一样本PGI、PGII结果存在差异，PGR结果取决于PGI、PGII结果，PGI、PGII结果差异叠加，会导致PGR离散程度增加，从而导致相关系数r下降。另外通过方法学比对，本研究观察到化学发光法测试PGI与其它两种方法存在明显的差异，PGI酶联免疫法与化学发光法，流式荧光发光法与化学发光法拟合直线方程分别为Y=1.344 4X+3.008 4，Y=1.343 6X+3.739 6。直线方程斜率提示，两种方法学之间存在较大的系统差异。而流式荧光发光法与酶联免疫法拟合直线方程为Y=0.972 9X+1.665，斜率为0.972 9，在0.9～1.1之间，提示两种方法学之间测值系统差异小。相对于PGI，PGII在三种不同方法学之间系统差异明显要小，PGII酶联免疫法与化学发光直线拟合方程为Y= 0.915 2X+0.689 5，流式荧光发光法与化学发光直线拟合方程为Y=0.938 7X+0.459 9，酶联免疫法与流式荧光发光法拟合直线方程为Y=0.966 7X+0.343 9，PGII方法学两两拟合直线，斜率均在0.9～1.1之间。PGI之所以在不同方法学之间存在较大测值差异，推测主要原因是由于PGI、PGII目前无参考测量程序以及无约定的参考测量物质，导致无法将结果通过合适的溯源途径在计量学上至统一的国际单位。该现象的存在，将导致PGI在采用不同检测方法的检测实验室无法实现检验结果互认。

通过三种不同方法检测PGI、PGII并获得PGR数据，三种方法的检验结果均表明在胃部良性疾病组、健康对照组两个组别中PGI与PGR两项指标与胃癌组均差异无统计学意义(P<0.05)，而PGII则在三个不同疾病组别中不存在组间差异(P>0.05)。这个结果表明PGII指标在胃癌辅助诊断中临床诊断价值不高。

考虑到不同方法学之间PGI存在系统差异，使用ROC曲线建立各自方法学PGI、PGR的最佳临界值。化学发光法中确定PGI临界值为47.20，PGR为2.83，流式荧光发光法PGI临界值为55.85，PGR为5.75，酶联免疫法PGI临界值为48.81，PGR为5.15。本方法确定的临界值与文献报道的临界值存在较大差异[12]，可能原因为：(1)入组样本存在差异；(2)样本量偏少；(3)入组人群与文献中入组人群本身差异。通过确定的临界值分析各个指标的灵敏度与特异度。结果表明单独以PGI作为临界值时，特异度明显较PGI、PGR两个指标要差。使用PGI、PGR在维持一定灵敏度的情况下能使特异度提高66.2%～84.1%提高至90%以上，同时提高了三种方法的阳性预测值。鉴于方法学间较高的相关性，三种方法学之间灵敏度与特异度上经卡方检验差异无统计学意义。

综上所述，三种常见方法学检测PGI、PGII存在较好的相关性，PGI在化学发光法中与另外两种方法学之间存在系统测值差异。通过临床评估，PGI结合PGR可以有效提高胃癌的诊断特异度与阳性预测值，具有较好的临床价值。

参考文献

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.031

(收稿日期：2016-02-12，修回日期：2016-04-08)

Clinical application of three different methods to the detection of Pepsinogen I and Pepsinogen II

YAN Min1,YAN Hualin2,LI Ming2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,105HospitalofPLA,Hefei,Anhui230031,China;2.FirstPeople’sHospitalofAnqing,Anqing,Anhui246004,China)

Abstract:ObjectiveTo study the clinical value of gastric cancer auxiliary diagnosis of three kinds of detection methods,using the chemiluminescent immunoassay (CLIA) ,flow type fluorescent light emitting method (FFIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect Pepsinogen I (PGI),Pepsinogen II (PGII).MethodsWith the method of comparison and correlation analysis,the consistency and correlation of the three methods are compared.The clinical serum samples of patients diagnosed with gastric cancer were tested and the critical values of PGI and PGI/PGII (PGR) were determined by using ROC curve to evaluate the sensitivity and specificity of the three methods.ResultsThe results of PGI and PGII in serum samples were tested by three different methods.And PGR was calculated according to the results of PGI and PGII.It was found that there were significant differences in the two indexes of PGI and PGR between gastric cancer group and non gastric cancer group,and there was no significant difference in PGII between the two groups.The comparative study found that the correlation coefficient between PGII and PGI was good,and the correlation coefficient r was in the range of 0.9612～0.9789,and the correlation coefficients of PGR among different methodology was in the range of 0.8602～0.9109.The sensitivities and specificities of CLIA,FFIA,ELISA were 67.6%,61.8%,58.8%,and 96.6%,94.7% and 96.6%,respectively.ConclusionsThere is good correlation among CLIA,FFIA,and ELISA detection of PGI,and PGII.Clinical evaluation indicates that PGI combined with PGR can effectively improve the diagnostic specificity and positive predictive value of gastric cancer,which has a good clinical value.

Key words:Pepsinogen A;Pepsinogen C;Luminescent Measurements;Flow Cytometry;Polymerase Chain Reaction