孙笑笑，王科，张彦

(1.无锡市第三人民医院，江苏 无锡　214041；2.重庆医科大学附属永川医院，重庆　402160；3.重庆医科大学，重庆　400016)



长链非编码RNA Linc00461干扰慢病毒的构建与鉴定

孙笑笑1，王科2，张彦3

(1.无锡市第三人民医院，江苏 无锡214041；2.重庆医科大学附属永川医院，重庆402160；3.重庆医科大学，重庆400016)

摘要：目的制备shRNA干扰人长链非编码RNA Linc00461的慢病毒载体(shRNA-Linc00461)，为进一步深入研究长链非编码RNA的功能奠定基础。方法利用在线干扰设计网页进行干扰引物设计，根据小干扰RNA的设计原则，选取三对针对Linc00461特异性干扰引物送公司合成。合成的片段连接到慢病毒载体质粒pSIH1-H1，形成pSIH1-H1-shRNA-Linc00461质粒。用PCR及测序对其进行鉴定，之后与慢病毒包装质粒混匀，由脂质体转染至HEK293T细胞进行包装，产生慢病毒shRNA-Linc00461，收集上清液使其感染乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过RT-PCR鉴定重组慢病毒干扰效果。并选取干扰效果最好的Linc00461感染MDA-MB-231细胞，运用MTT和流式细胞术检测细胞增殖和周期的改变。结果SIH1-H1-shRNA Linc00461质粒经PCR验证和测序后，证实其构建成功。shRNA-Linc00461在HEK293T细胞中重组成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231，感染效率约为70%。shRNA-Linc00461感染乳腺癌MDA-MB-231细胞后Linc00461的表达下调65.32%； 感染shRNA-Linc00461第3天MTT 结果显示：实验组吸光度值(0.232±0.032)明显低于实验对照组(0.398±0.037)。流式结果提示实验组G2M 期细胞(47.55±5.063)%高于实验对照组(8.876±3.565)%。结论成功构建了shRNA-Linc00461慢病毒载体，并能有效抑制Linc00461表达，为深入研究人Linc00461基因功能奠定了基础。

关键词：RNA,小分子干扰;乳腺肿瘤;慢病毒属

在女性恶性肿瘤中，最常见的是乳腺癌，占第一位。其中中青年妇女乳腺癌的发病率呈逐年上升状态[1]。乳腺癌是一个多基因多因素参与的复杂性疾病,病理机制极其复杂，乳腺癌的诊断目前主要是依据蛋白类肿瘤标志物的筛查和影像学检查。……