毕晓军，李健，范连慧，刘龙，何龙

(沈阳军区总医院泌尿外科，辽宁 沈阳　110016)



表柔比星对膀胱癌细胞中miR-21表达的影响

毕晓军，李健，范连慧，刘龙，何龙

(沈阳军区总医院泌尿外科，辽宁 沈阳110016)

摘要：目的表柔比星是膀胱灌注辅助治疗膀胱癌的常用药物，该研究主要通过研究表柔比星对膀胱癌细胞中miR-21表达的影响，从而探讨表柔比星治疗膀胱癌的作用机制。方法该研究通过向膀胱肿瘤细胞中加入不同浓度表柔比星培养细胞后，检测细胞中miR-21表达量的变化情况。结果随着表柔比星浓度的增加，膀胱癌细胞5637中的miR-21的表达水平下降。观察组不同浓度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，随着表柔比星浓度的增加，人膀胱癌5637细胞中的miRNA-21的表达水平下降，即呈剂量依赖趋势。结论表柔比星能够抑制膀胱癌细胞中miR-21的表达，并呈浓度依赖趋势。

关键词：膀胱肿瘤;表柔比星;微RNAs

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第1位，膀胱肿瘤具有较高的复发率和侵袭能力，多以浸润方式生长。近年来随着人口老龄化等膀胱癌的发病率和死亡率呈逐年上级趋势[1]。MicroRNAs(miRNAs，微小RNA)是一类在病毒、植物和动物等生物体中广泛存在的进化上保守的内源性非编码蛋白质小RNA。在RNA的降解以及蛋白抑制方面有着非常重要的作用，从而影响细胞的增值、分化和凋亡等过程[2]。已有研究表明miR-21在膀胱癌中存在过表达。目前非肌层浸润性膀胱癌多以经尿道膀胱肿瘤电切术术后辅助表柔比星灌注化疗为主。本文通过研究表柔比星与microRNA的关系的基础研究，希望在分子生物学水平找到一条新的预防膀胱癌复发的道路。

1　资料与方法

1.1材料5637细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，所有细胞采用贴壁细胞法培养、传代及保留，取对数生长期细胞进行试验。表柔比星购于浙江海正药业股份有限公司，PCR试剂盒及逆转录试剂盒均购于大连Takara公司。引物由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，simiR-21及si-negative control均由上海吉玛制。

1.2细胞培养培养于含10%小牛血清的RPMI-1640，在95 %湿度、CO2体积分数为5%、条件下培养。将5×105的5637细胞接种至6孔板中，用2 mL的培养液(含10%血清和抗生素)培养。24 h后，向各组细胞中加入表柔比星，用PBS作为对照。各组别的药物终浓度分别为0.0、0.25、 0.5、1.0、2.0 mg·L-1培养48 h后，裂解细胞并分析其miR-21的表达。

1.3qRT-PCR检测用TRIzol试剂提取5637细胞系总RNA，用miR-21检测试剂盒检测miR-21表达水平。 首先取10 ng总RNA与3 μL逆转录酶混合，在15 μL反应体系中，16 ℃ 30 min，42℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录。然后将逆转录产物cDNA150倍稀释，取2 μL稀释的cDNA150与2 μL TaqMan引物混合，在20 μL反应体系中，95℃变性10 min；95℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。细胞中miRNA表达用U6 snRNA为内对照，相对miRNA表达水平用2-ΔΔCt计算改变倍数，相对miRNA表达水平用2-ΔCt计算改变倍数。

1.4统计学方法所有实验结果数据均采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miRNA-21及内参U6的基因表达谱目的基因(miRNA-21)的溶解扩增曲线见(图1)，溶解曲线见(图2)；内参基因(U6)的扩增曲线见(图3)，溶解曲线见(图4)。

图1　miR-21的扩增曲线

图2　miR-21的溶解曲线

图3　U6扩增曲线

图4　U6溶解曲线

2.2加入不同浓度表柔比星后，5637细胞中miR-21的表达水平变化观察组中表柔比星终浓度分别为0.0、0.25、0.5、1.0、2.0 mg·L-1，对照组用PBS溶液培养细胞，应用RT-PCR法检测上述标本中miRNA-21的表达水平。随着表柔比星浓度的增加，膀胱癌细胞5637中的miR-21的表达水平下降。观察组不同浓度与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。对所得结果作直线回归的统计推断，可建立回归方程，对回归方程作假设检验，F=24.924，作出统计推断，得P<0.01，回归方程差异有统计学意义，可确定表柔比星浓度与miR-21之间有直线回归关系。即观察组用不同浓度表柔比星培养，在一定浓度内随着表柔比星浓度的增加，人膀胱癌5637细胞中的miRNA-21的表达水平下降，即呈剂量依赖趋势(图5)。

表1　不同浓度表柔比星转染后，各组细胞中 miR-21的表达水平

图5　不同浓度表柔比星对膀胱癌HTB-9细胞 miRNA-21的表达水平

3　讨论

miRNA是在存在于广泛动植物体内的一种非编码小RNA，包含大约1 000个短小核苷酸片段和18～25个长核苷酸片段的非编码RNA，在转录后控制水平与特定信使RNA转录物的互补序列结合来调控基因表达[3-4]。可调控人类基因的60%。一种miRNA可有多种靶点，许多种miRNA也可有一个共同靶点[5]。主要参与基因转录后水平的调控，通过与其目标mRNA分子的非编码区域互补匹配降解靶mRNA或抑制其翻译。在被miRNA调控的基因中，大约有50%的基因与肿瘤相关基因区或脆弱基因区相关联[6]。不同肿瘤组织中，miRNA呈现不同基因序列。Let-7家族的多种成员在多种肿瘤组织中呈抑制性表达。体内、外模型试验提示let-7可以使肿瘤维持现状或抑制肿瘤生长。肿瘤几乎对所有化疗药物都可以产生抵抗。研究表明，miRNA能调解肿瘤细胞的化疗敏感性。Blower等[7]采用转染miRNA和反义核酸抑制的方法，发现let-7i、miR-16、miR-21影响化疗药物的疗效高达4倍。通过体外试验研究药物抵抗的机制，可以帮助我们提高临床治疗水平。

miRNA通过转录后调控机制广泛参与了各种生命活动进程。miRNA-21对肿瘤的致癌作用具有普遍性，在膀胱癌中也扮演重要角色，其主要定位于细胞核，呈高度表达，并在膀胱癌细胞分级机临床分期中扮演重要角色。miRNA-21是最常见的表达上调miRNA，具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，进而加速肿瘤生长转移的作用。与膀胱癌密切相关的细胞凋亡因子4(PDCD4)和抑癌基因(PTEN)及TPM1，多项研究发现miRNA-21可对其进行调控，从而证明miRNA-21与膀胱癌关系密切[8-10]。战鹏等[11]通过免疫组织化学法发现miRNA-21在膀胱癌组织中的表达明显高于膀胱正常组织，并随着临床分期和细胞分级增高，miRNA-21的阳性表达率逐渐升高，说明其表达与膀胱癌的恶性程度和严重性呈正相关，与年龄和性别无关。

本研究采用RT-PCR方法检测了不同浓度表柔比星条件下膀胱癌5637细胞中miRNA-21的表达水平，研究结果显示表柔比星能够有效的降低膀胱癌细胞5637中的miR-21的表达，并且呈Dose dependent 趋势。不但从再次证实了膀胱癌细胞中miRNA-21的表达高于正常组织，更从分子生物学水平证实了表柔比星在抑制膀胱癌复发方面的有效性。

膀胱癌术后早期复发或进展是导致膀胱癌预后不佳的重要因素[12]。虽然目前已发现较多膀胱癌的复发原因，并通过联合用药等多种方法治疗膀胱癌，虽可在一定程度上抑制膀胱癌的复发，但临床效果欠佳。在临床治疗过程或治疗结束后，膀胱癌往往复发。目前关于抗肿瘤的药物机制多集中在抗肿瘤药物对细胞周期的影响，并且对其机制的解释往往不能使人信服。本实验首次关注了抗肿瘤药物对膀胱癌相关基因表达影响。根据本实验研究结果分析，表柔比星能抑制miR-21的表达，并呈浓度依赖趋势。因此，给将来研究新的抗肿瘤药物提供了一种新的途径，可以在分子生物学水平上验证抗肿瘤药物的有效性。

参考文献

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[3]桂瑞丰,胡文辉.miRNA在肝癌患者血清中的表达及意义[J].安徽医药,2016,20(1):126-128.

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[9]Huang GL，Zhang XH，Guo GL，et al．Clinical significance of miRNA-21 expression in breast cancer[J].Oncol Rep，2009,21(3):673.

[10] 鄢文,靳文,王昂,宋维舒,等.贝伐单抗联合培美曲塞维持治疗对晚期非鳞状非小细胞肺癌患者循环microRNA-19以及白细胞介素-27表达的影响[J].安徽医药,2015,19(9):1786-1790.

[11] 战鹏，张明.微小RNA-21在膀胱癌中的表达和临场意义[J].中国老年学杂志，2012,22(32):4872-4873.

[12] Palou J，Algaba F，Vera I，et al．Protein expression patterns of ezrin are predictors of progression in T1 G3 bladder tumours treated with nonmaintenance bacillus Calmette-Guérin[J].Eur Urol,2009,56(5):829-836.

◇药物分析◇

作者简介：毕晓军，男，硕士研究生

通信作者：何龙，男，副主任医师，研究方向：膀胱肿瘤，E-mai：helongyh@vip.qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.012

(收稿日期：2016-01-04，修回日期：2016-04-11)

Effect of epirubicin on the expression of miR-21 in bladder cancer cells

BI Xiaojun，LI Jian，FAN Lianhui，et al

(DepartmentofUrologySurgery,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110016,China)

Abstract:ObjectiveEpirubicin is a commonly used drug for assisted bladder perfusion treatment of bladder cancer.This study is to explore the mechanism of epirubicin in the treatment of bladder cancer by studying the effect of epirubicin on the expression of miR-21 in bladder cancer cells.MethodsThe expressive levels of miR-21 were detected by adding different concentrations of epirubicin in cultured cells to bladder cancer cells.ResultsThe expression level of miR-21 in bladder cancer cell 5637 was decreased with the increase of epirubicin.The difference was statistically significant between the observed groups with different concentrations and the control group(P<0.05).With epirubicin concentration increased,the expression level of miRNA-21 in human bladder cancer 5637 cells decreased,i.e.in a dose dependent trend.ConclusionsEpirubicin can inhibit the expression of miR-21 in bladder cancer cells,which shows a dose-dependent trend.

Key words:Urinary Bladder Neoplasms;Epirubicin;MicroRNAs