尹鲜思，王少岭，崔益平，陈秋红，王国梁,2，王志龙*

(1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.美国俄亥俄州立大学植物病理系，俄亥俄 哥伦布 43210)



抗水稻黑条矮缩病转基因材料的鉴定分析

尹鲜思1，王少岭1，崔益平1，陈秋红1，王国梁1,2，王志龙1*

(1.湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2.美国俄亥俄州立大学植物病理系，俄亥俄 哥伦布 43210)

针对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)的核心粒子外壳蛋白基因(S8)、毒质与非结构蛋白基因(S9)及其嵌合基因(S8&S9)构建了6个RNAi载体，经农杆菌介导转化武陵粳1号获得转基因植株。通过潮霉素溶液浸泡法对转基因植株进行初步筛选，剔除假阳性植株；再通过PCR从DNA水平进行转基因阳性鉴定；进一步通过qRT–PCR 从RNA水平进行转基因表达量分析。选取qRT–PCR表达量高的单拷贝纯系S8后代进行灰飞虱传毒试验，结果表明，含有S8 RNAi片段的转基因水稻材料对RBSDV具有一定抗性。

水稻；水稻黑条矮缩病；转基因株系；RNA干扰；荧光定量PCR

投稿网址：http://xb.ijournal.cn

水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)引起的一种病毒性病害，发病植株表现为矮化、分蘖增多，叶片短阔、僵直，叶色浓绿，叶脉和茎秆呈蜡白色，渐变为褐色短条瘤状隆起，穗小或不抽穗结实[1–3]。RBSDV的宿主主要有水稻、玉米、小麦等禾本科植株，其传播媒介为灰飞虱和白背飞虱[4–6]。水稻黑条矮缩病20世纪50年代在日本被首次报道[7]，并于1968年大规模暴发，导致粮食减产绝收[8]。20世纪 60年代在中国首次被报道[9–10]。20世纪90年代末以来，在中国南方稻区再次暴发流行，造成水稻大面积减产[11]。

水稻黑条矮缩病毒属呼肠孤病毒科斐济病毒属，其病毒粒子为直径75~80 nm的二十面体，包含双层衣壳[12–13]，具有外层衣壳上的 A–突起和核心粒子表面的 B–突起[14]。RBSDV全基因组由 10条双链RNA(dsRNA)组成[15]，分别命名为S1~S10，其对应编码蛋白分别为P1~P10，其中，S8具有1 927 bp，P8的相对分子质量为65 000，属小核衣壳结构蛋白，在RBSDV侵染过程中抑制转录[16]。S9具有1 900 bp，含2个非重叠ORFs，分别编码P9–1和P9–2，P9–1为聚集在侵染细胞的病毒基质，参与病毒复制和聚集，P9–2为非结构蛋白[17]。

Jia等[18]针对P7–1基因进行RNA干扰，有效抑制了病毒在昆虫媒介的传播；Shimizu等[10]对P9–1进行干扰，发现可以达到抗病效果。笔者针对水稻黑条矮缩病毒核心粒子外壳蛋白基因(S8)、毒质与非结构蛋白基因(S9)及 S8&S9嵌合片段，利用两步法快速高效构建了6个RNAi载体，经农杆菌介导转化武陵粳 1号，获得阳性转基因植株，并通过qRT–PCR选择双链RNA表达量高的单拷贝纯系进行了灰飞虱传毒试验与抗性评估，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

水稻武陵粳1号(高感RBSDV)；已感染RBSDV水稻病株及叶片(贮藏于–80 ℃冰箱，扬州大学左示敏教授惠赠)；灰飞虱(湖南农业大学饲养)。

1.2方法

1.2.1RNA干扰载体的构建

使用pENTR载体和pANDA载体，参照两步法[19]，构建RBSDV S8、S9及S8&S9的RNA干扰载体(PCR引物见表1)。

表1　PCR和qRT–PCR引物信息Table 1 Sequence information for PCR and qRT–PCR primers

S8的RNAi干扰载体的构建：以含有RBSDV的水稻叶片cDNA为模板，扩增 S8干扰片段，将其连接到入门载体pENTR上，经BamHI、XhoI双酶切和测序验证后，再与目的载体pANDA进行重组反应，阳性重组子经菌落PCR及KpnI、SacI双酶切验证后，用于转化农杆菌。S9的RNAi干扰载体构建与S8的相同。

S8–1&S9–2嵌合片段载体的构建：以已构建的pENTR–S8–1为模板，S8–1–F与A引物扩增嵌合片段中的S8–1部分；以pENTR–S9–2为模板，B引物与S9–2–R引物扩增嵌合片段中的S9–2部分，A引物与B引物为反向互补序列(表1)，将2个片段分别切胶回收，共同作为模板，S8–1–F与S9–2–R引物扩增整个嵌合片段，再连接到入门载体pENTR上，BamH I、XhoI双酶切验证，测序正确后，与pANDA进行重组反应，重组子采用菌落PCR和质粒KpnI、SacI双酶切验证，正确重组子用于转化农杆菌。S8–2&S9–1的 RNAi干扰载体构建与S8–1&S9–2的相同。

1.2.2根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

运用电击法，将构建的 RNAi载体 pANDA–S8/S9/S8&S9转入根癌农杆菌EHA105中，挑取阳性克隆进行PCR验证和双酶切(KpnI和SacI)验证。采用农杆菌介导的水稻转化法转化水稻黑条矮缩病高感品种武陵粳1号，采用潮霉素筛选法，获得转基因植株。

1.2.3转基因阳性植株的鉴定与表达分析

将得到的转基因 T1代植株从生根培养基上取出，洗净根部培养基，移植到大田，待植株健壮后，剪取少许叶片置于含有潮霉素溶液(质量分数0.1%)的管子中浸泡5~7 d；选取潮霉素溶液鉴定阳性(叶片仍为绿色)的植株，提取其叶片基因组 DNA，使用目的引物(表1)进行转基因PCR阳性鉴定。再对PCR鉴定为阳性的植株进行qRT–PCR表达量分析，确定插入片段的转录水平，以鉴定转基因阳性表达效率。进一步选取转基因T2代及T3代阳性植株，进行潮霉素溶液鉴定，PCR及qRT–PCR分析，筛选高表达目的片段的T3代单拷贝转基因纯系。

1.2.4灰飞虱室内传毒与转基因植株的抗性鉴定

将挑选的T3代单拷贝转基因纯系浸种发芽，水稻幼苗在温室采用长日照培养(光照 14 h，温度26 ℃，相对湿度80%；黑暗10 h，温度20 ℃，相对湿度保持不变)。在人工气候模拟培养箱中饲养灰飞虱，恒温27 ℃，相对湿度70%，光照16 h。用感染RBSDV的水稻叶片饲养灰飞虱。待T3植株长到四叶期进行灰飞虱传毒，持续20 d，期间不定时驱赶灰飞虱取食待传毒水稻叶片，保证传毒效率最大化。传毒完成后，随机抓取一定量传毒灰飞虱，提取RNA，RT–PCR检测其带毒率。将完成传毒的水稻幼苗移栽到大田中，观察水稻抽穗期表型，确定水稻是否发病。

2　结果与分析

2.1RNAi载体的构建与验证

选取编码RBSDV结构蛋白基因S8以及S9作为构建RNAi干扰载体的候选基因，利用入门载体及LR重组反应[19]，构建2个S8片段S8–1和S8–2以及2个S9片段S9–1和S9–2的干扰载体(图1)。

图1　RBSDV S8 RNAi载体的构建Fig. 1 The construction of RNAi vector for RBSDV S8

为了增强干扰效果，将S8基因和S9基因利用Overlapping PCR方法拼接到一起构成一个较大的RNA干扰片段，共构建2个嵌合片段 S8–1&S9–2 和S8–2&S9–1的RNAi载体，pANDA–S8&S9的构建如图2所示。

图2　RBSDV S8&S9 RNAi载体构建Fig.2 The construction of RNAi vector for RBSDV S8&S9

2.2转基因水稻植株的阳性鉴定

对经农杆菌介导法转化获得的转基因水稻植株，采取了潮霉素溶液浸泡法、PCR扩增以及qRT–PCR表达量分析3个步骤进行鉴定。

图3　RBSDV S8–1转基因植株的潮霉素浸泡鉴定结果Fig.3 The identification of transgenic plants with RBSDV S8–1 by hygromycin detection

将得到的转基因 T1代植株采用潮霉素浸泡法进行初步筛选。S8–1的RNAi转基因株系，阳性植株具有潮霉素抗性，叶片表现为绿色(如 CK+，已确定的转基因植株)，未转基因的 CK–叶片呈黄色(图3)，由此初步鉴定1~8号、11~15号为转基因阳性，9号和10号为转基因阴性植株。将初步鉴定的转基因阳性植株(1~8号、11~15号)提取DNA，以未转基因植株为阴性对照，载体pANDA–8–1为阳性对照，使用目的片段引物进行 PCR扩增，如图4–A所示。1~8号及11~15号的扩增片段与阳性对照大小一致，确定这13株植株中插入了目的基因片段。从中选取 7株(1、2、3、5、6、14、15号)进行qRT–PCR表达量分析，如图4–B，以武陵粳1号为对照组(WT)，RBSDV基因与水稻基因组无同源性，测量S8与水稻泛素基因(Ubiquitin，UBQ)的表达量比值(S8/UBQ)，与对照组相比，7株转基因材料相对表达量均有一定程度的增加，其中在8号植株中增加约60倍，在2号和14号植株中分别增加约36、41倍，进一步表明RBSDV外源片段已导入水稻中，并且可以在水稻中转录，为转基因阳性植株。对转基因阳性植株的T2代，继续采用上述3个步骤筛选，以获得目的基因单拷贝插入的高表达株系，并筛选其T3代纯系用于病毒传毒鉴定。

图4　RBSDV S8–1转基因植株鉴定结果Fig.4 The identification of transgenic plants with RBSDV S8–1

按照以上筛选方式，对pANDA–S9–1转基因阳性植株进行鉴定，如图 5–A所示。PCR鉴定显示14株T1转基因植株中，有12株(1~6号、9~14号)为阳性植株，2株(7、8号)为阴性植株。选取2号和5号植株的T2代高表达株系进行qRT–PCR表达量分析，结果(图5–B)显示，T2转基因植株2–4的相对表达量高达约800倍，T2转基因植株2–1和5–1的相对表达量约600倍，其余植株的相对表达量约200~400倍，这些高表达株系将用于筛选单拷贝的T3代纯系。

图5　RBSDV S9–1转基因植株鉴定结果Fig.5 The identification of transgenic plants with RBSDV S9–1

同样地，对pANDA–S8&S9转基因阳性植株进行鉴定，如图6–A所示。结果显示，17株T1转基因植株中，有16株(1~11号、 13~17号)为阳性植株，1株(12号)为阴性植株。选取1、25和30号植株的T2代进行qRT–PCR表达量分析，结果显示(图6–B)，植株1号的3株T2代(1–2号、1–4号, 1–6 号)相对表达量约为20~60倍，其余植株的相对表达量均低于20倍，相对表达量高于20倍的株系被考虑用于筛选T3代的单拷贝纯系。

图6　RBSDV S8–1&S9–2转基因植株鉴定结果Fig.6 The identification of transgenic plants with RBSDV S8–1&S9–2

2.3转基因水稻植株的传毒接种与鉴定

在进行传毒试验之前，提取RBSDV病毒供体水稻单株材料叶片 RNA，采用 S8基因引物进行RT–PCR分析，以水稻Ubiquitin基因作为对照，检测供体材料带毒情况，如图 7–A所示。高表达RBSDV病毒S8基因的水稻单株4号和5号可以用来作为接种RBSDV的供体。

图7　感染RBSDV水稻病株鉴定Fig.7 The identification of infected plants with RBSDV and inoculation of RBSDV by Lalielphax striatellus

根据图4–B的qRT–PCR表达量分析结果，选取S8–1的6号转基因株系T3后代纯系种子，于播种后植株2~3叶期，开始采用离体叶片法，进行灰飞虱传毒，如图7–B所示。传毒完成后，通过检测传毒灰飞虱的带毒率来确定传毒效果，若带毒率高于80%便认定传毒有效。

经有效传毒后，植株在同等生长条件下，继续生长25 d，观察表型变化。已接受传毒的武陵粳1号与转基因材料相比，植株生长缓慢，部分植株干枯而死，叶片上出现条纹病斑，而携带有 RBSDV 的S8–1 RNAi干扰载体的转基因植株以及未进行传毒的武陵粳1号则正常生长，植物无枯死现象，叶片也无明显病斑(图 8–A、图 8–B)。温室接种数据初步表明，含有 S8–1 RNAi片段的转基因材料对RBSDV具有一定抗性。

图8　S8–1转基因植株传毒后的表型Fig.8 The phenotypes of S8–1 transgenic plants after RBSDV inoculation

3　结论与讨论

水稻黑条矮缩病具暴发性、间歇性和迁移性，其防控难度极大。针对RBSDV的S8、S9及S8&S9嵌合基因，通过两步法构建了6个RNAi载体，转化高感水稻品种武陵粳1号，获得了S8、S9及S8&S9 的RNAi转基因材料。由于获得的转基因材料较多，因而先采用潮霉素浸泡法(较简便有效)对转基因材料进行初步筛选，排除假阳性，以降低后续工作量。接着利用PCR鉴定目的基因是否整合到阳性植株基因组中，再通过qRT–PCR测量目的基因在转基因植株的相对表达量。通过上述对水稻转基因阳性植株的层层递进鉴定，成功筛选到了 S8、S9及 S8&S9嵌合基因的RNAi转基因阳性植株，为RBSDV室内接种及田间抗性鉴定提供了材料基础。

在进行RBSDV室内接种前，先确定田间采集的水稻矮化病株是否带毒。在接种过程中，检测了新鲜的及冻存的水稻带毒叶片，发现二者均能使灰飞虱有效传毒，特别是冻存的水稻带毒叶片，能够全年安排灰飞虱传毒试验，进行田间抗性鉴定。

在目前获得的转基因材料中，仅对S8的RNAi株系进行了室内接种鉴定及表型观察，初步结果表明，含有S8 RNAi片段的转基因水稻对RBSDV具有一定抗性，但还有待大量接种病毒后的田间群体表型鉴定。同样，含有S9以及S8&S9 RNAi片段的转基因材料也需要室内大量接种和田间群体表型鉴定。由于使用的目的载体pANDA含有筛选标记抗潮霉素基因，考虑到水稻为重要粮食作物，将在后续试验中采用无筛选标记转基因技术获取抗RBSDV的转基因材料，以便用于水稻育种与种质创新。

[1] Conti M，Lovisolo O．Tubular structures associated with maize rough dwarf virus particles in crude extracts：electron microscopy study[J]．Journal of General Virology，1971，13(1)：173–176．

[2] Milne R G，Lovisolo O．Maize rough dwarf and related viruses[J]．Advances in Virus Research，1977，21：267–341．

[3] 王华弟，祝增荣，陈剑平，等．水稻黑条矮缩病发生流行规律监测预警与防控关键技术[J]．浙江农业学报，2007，19(3)：141–146．

[4] Identification of rice black streaked dwarf Fijivirus in maize with rough dwarf disease in China[J]．Archives of Virology，2001，146(1)：167–170．

[5] Bai F W，Yan J，Qu Z C，et al．Phylogenetic analysis

reveals that a dwarfing disease on different cereal crops in China is due to rice black streaked dwarf virus(RBSDV)[J]．Virus Genes，2002，25(2)：201–206．

[6] 中国科学院上海生物化学研究所病毒组．水稻黑条矮缩病病原体的研究Ⅰ．传毒灰稻虱体中类似病毒的质粒[J]．中国科学：A辑，1974，17(2)：158–167．

[7] Kuribayashi K，Shinkai A．On the rice black-streaked dwarf disease，a new disease of rice in Japan[J]．Annals of the Phytopathological Society of Japan，1952，16：41．

[8] Ishii M，Yoshimura S．Epidemiological studies on rice black-streaked dwarf virus in Kanto–Tosan district in Japan[J]．J Cent Agric Exp Sta，1973，17：61–121．

[9] Wu J，Ni Y，Liu H，et al．Development and use of three monoclonal antibodies for the detection of rice black-streaked dwarf virus in field plants and planthopper vectors[J]．Virology Journal，2013，10：114．

[10] Shimizu T，Nakazono–Nagaoka E，Akita F，et al. Immunity to rice black streaked dwarf virus，a plant reovirus，can be achieved in rice plants by RNA silencing against the gene for the viroplasm component protein[J]. Virus Research，2011，160(18)：400–403．

[11] Wang H D，Chen J P，Wang A G，et al．Studies on the epidemiology and yield losses from rice black-streaked dwarf disease in a recent epidemic in Zhejiang province，China[J]．Plant Pathology，2009，58(5)：815–825．

[12] Redolfi P，Boccaroo G．Fractionation of the doublestranded RNA of maize rough dwarf virus subviral particles[J]．Virology，1974，59(1)：319–322．

[13] Shikata E，Kitagawa Y．Rice black-streaked dwarf virus：its properties，morphology，and intracellular localization [J]．Virology，1977，77(2)：826–842．

[14] 邓金奇，戴良英．水稻黑条矮缩病毒的研究进展[J]．中国农学通报，2012，28(18)：209–212．

[15] 孙枫，徐秋芳，程兆榜，等．中国水稻黑条矮缩病研究进展[J]．江苏农业学报，2013，29(1)：195–201．

[16] Liu H，Wei C，Zhong Y，et al．Rice black-streaked dwarf virus minor core protein P8 is a nuclear dimeric protein and represses transcription in tobacco protoplasts[J]. FEBS Letters，2007，581(13)：2534–2540．

[17] Isogai M，Uyeda I，Lee B C．Detection and assignment of proteins encoded by rice black streaked dwarf Fijivirus S7，S8，S9 and S10[J]．Journal of General Virology，1998，79：1487–1494．

[18] Jia D，Mao Q，Chen H，et al．Virus-induced tubule：a vehicle for rapid spread of virions through basal lamina from midgut epithelium in the insect vector[J]．Journal of Virology，2014，88(18)：10488–10500．

[19] 王少岭，杜强，尹鲜思，等．两步法构建灰飞虱RNAi载体及水稻遗传转化[J]．作物研究，2015，29(3)：230–234．

责任编辑：罗慧敏

英文编辑：罗 维

Identification and analysis of transgenic lines against rice black-streaked dwarf virus

Yin Xiansi1, Wang Shaoling1, Cui Yiping1, Chen Qiuhong1, Wang Guoliang1,2, Wang Zhilong1*
(1.College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Department of Plant Pathology, The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210, USA)

Genome segments S8 (encoding minor core capsid protein), S9 (encoding virplasm and non-structual protein) and their chimeric sequences S8&S9 of RBSDV were used to construct six RNAi vectors and transferred into rice cultivar Wulingjing 1 to generate transgenic plants by Agrobacterium-mediated transformation. Transgenic plants were first screened by immersion with hygromycin solution to eliminate the false-positive plants, then identified by PCR genotyping analysis from the DNA level，followed by qRT–PCR analysis of candidate genes at the RNA level. Single-copy transgenic lines with high expression of S8 detected by qRT–PCR were picked up for Laodelphax striatellus-mediated virus transmission test, and the results showed that transgenic lines containing S8 RNAi vector displayed resistance to RBSDV.

rice; rice black-streaked dwarf virus (RBSDV); transgenic lines; RNA interference (RNAi); qRT–PCR

；*通信作者，王志龙，博士，教授，主要从事作物遗传育种与水稻抗逆分子生物学研究，zhilongwang@126.com

Q786

A

1007-1032(2016)04-0380-06

2016–03–24 修回日期：2016–04–08

转基因生物新品种培育重大专项 (2012ZX08009001)；教育部创新团队发展计划项目(IRT1239)；湖南农业大学大学生创新性实验计划项目(XCX15145)

尹鲜思(1990—)，男，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事水稻抗逆分子生物学研究，1614974545@qq.com；王少岭为共同