鲁宇青　韩进超　丛旭　魏来　潘孝本

100044 北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室



应用CRISPR/Cas9系统靶向切割细胞内乙型肝炎病毒基因组的研究

鲁宇青韩进超丛旭魏来潘孝本

100044 北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室

【摘要】目的应用近年发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR)引导的Cas9核酸酶特异性靶向切割HBV DNA基因。方法基于慢病毒载体的lentiCRISPRv2系统，我们设计了3个特异靶向HBV基因组的向导RNA序列(guide RNA, gRNA)。质粒pUC18-HBV1.2和lentiCRISPR-gRNAs共转染HepG2细胞，或lentiCRISPR-gRNAs与相关慢病毒载体转染293T细胞后产生相应慢病毒。用慢病毒处理整合了HBV DNA的HepG2.2.15细胞或者HepDE19细胞系；并用慢病毒处理基于C57BL/6小鼠腺相关病毒HBV复制模型。结果单靶向CRISPR/Cas9切割可以抑制30%～50%病毒蛋白产生。两个或三个靶向切割则显著提高抑制效率，可达70%～90%。以慢病毒体系处理HepG2.2.15或HepDES19细胞时，HepDES19细胞中HBeAg下降幅度约为HepG2.2.15细胞中的3倍。HBV复制小鼠模型在CRISPR/Cas9慢病毒处理后，血清中HBsAg和HBeAg可转为阴性。结论CRISPR/Cas9系统多位点靶向切割可高效清除细胞内基因组，相对于整合于染色体的基因组，游离于细胞核的HBV基因组对此靶向切割系统更加敏感。

【主题词】肝炎,乙型；共价闭合环状DNA；CRISPR/Cas9；基因；抗病毒

Fundprogram:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81170386)

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)是双链嗜肝DNA病毒，其感染肝细胞后，病毒基因组在HBV核心蛋白介导下进入细胞核，可形成非整合型的微染色体，作为病毒转录和复制模板长期存在，是当前抗病毒治疗停药后复发及耐药发生的关键原因[1,2]。……