王　飞，李周坤，董维亮，崔中利①

(1. 江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室/ 江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌　330045；2.南京农业大学生命科学学院/ 农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，江苏 南京　210095)



一种检测2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺水解酶活性的方法

王飞1，2，李周坤2，董维亮2，崔中利2①

(1. 江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室/ 江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌330045；2.南京农业大学生命科学学院/ 农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，江苏 南京210095)

摘要：建立了一种快速测定Delftia acidovorans T3-6菌株2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺(CMEPA)水解酶活性的方法。在20 mmol·L-1Tris-HCl(pH 值为7.0)缓冲液中，10～50 μmol·L-1的CMEPA水解产物2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)在铁氰化钾催化下与4-氨基安替比林反应生成紫红色物质，该物质在535 nm处的吸光度(y)与MEA浓度(x)呈正相关(y=0.014 6x-0.005 4，R2=0.998 8)。底物CMEPA、十二烷基硫酸钠(SDS)、甲醇等有机试剂以及1 mmol·L-1金属离子对显色反应无显著影响，温度和pH值对显色反应影响显著。4-氨基安替比林显色法对菌株T3-6粗酶液酶活性的测定结果与二氯甲烷萃取-紫外分光光度法无显著差异。该方法也适用于其他苯胺苯酚类衍生物的测定。

关键词：2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)；4-氨基安替比林显色法；分光光度法；Delftia acidovorans T3-6

2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)是苯胺的一种衍生化合物,也是氯乙酰胺类除草剂乙草胺生物降解的中间代谢产物之一[1]。同其他苯胺类化合物一样,MEA是严重污染环境和危害人体健康的有害物质[2]。鉴于大部分苯胺类化合物都具有致突变和致癌作用,它们在环境中的残留、检测及微生物降解得到广泛关注[3]。

目前对环境中苯胺的检测方法主要有分光光度法和色谱法2种[4]。色谱法由于仪器等原因,不适于快速大量检测,简便的苯胺测定方法为紫外分光光度法和偶氮比色法。MEA在284 nm处有最大紫外吸收峰,因此可通过二氯甲烷萃取后测定284 nm波长下的吸光度来检测MEA含量[5],但MEA易随着二氯甲烷挥发,不易准确测定。偶氮比色法常用的显色剂为萘乙二胺和安基比林、4-氨基安替比林和茜素红S等[6]。4-氨基安替比林显色法通常被用于苯酚的检测,在碱性条件下,苯酚经铁氰化钾催化与4-氨基安替比林反应生成紫红色物质,在515 nm波长下有最大吸收峰[7]。在用该显色法测定苯酚时,苯胺及其衍生物对吸光度有较大的干扰,推测干扰物质也具有类似的反应[8]。DelftiaacidovoransT3-6是从生产乙草胺的农药厂活性污泥中分离获得的一株能高效水解2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺(CMEPA)的菌株,水解产物为MEA[9]。该研究利用MEA与4-氨基安替比林显色的特点,建立了CMEPA水解酶活性的快速测定方法。

1材料与方法

1.1材料

CMEPA、MEA和2,6-二乙基苯胺由青岛沃克生物技术有限公司合成,4-氨基安替比林、铁氰化钾、苯胺、2,3-二甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、2,5-二甲基苯胺、邻甲基苯胺、4-氨基酚、苯酚、邻硝基酚、间甲基酚、3,5-二甲基苯酚、2氨基4氯酚、2氨基5氯酚、对硝基苯基乙酰胺和邻苯二酚均购于国药集团化学试剂有限公司。

菌株:DelftiaacidovoransT3-6,由笔者所在实验室分离并鉴定,保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号:CCTCC NO:M 2012526)。

LB培养基: 酵母粉 5.0 g·L-1,胰蛋白胨 10.0 g·L-1,NaCl 10.0 g·L-1,pH值为7.0～7.2。

1.2仪器

SHIMADZU UV-2401紫外可见分光光度计,KUBOTA 201M超声波破碎仪,Beckman Allegra X-22R台式高速冷冻离心机。

1.3显色反应测定波长的确定[8]

取0.1 mmol·L-1MEA溶液0.5 mL,加入0.1 mol·L-14-氨基安替比林溶液50 μL、0.2 mol·L-1铁氰化钾溶液50 μL,加去离子水补足体系至5 mL,以不含MEA的溶液体系作为参比溶液,稀释10倍后在分光光度计400～700 nm波长下扫描。

1.4标准曲线绘制

在反应体系中加入不同量的MEA标准液,使终浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、15、20、25、30、35、40、50 μmol·L-1,加入4-氨基安替比林和铁氰化钾溶液,使终浓度分别为1和2 mmol·L-1,稀释10倍后在535 nm波长条件下测定吸光度(D535),以MEA浓度为横坐标、D535为纵坐标绘制标准曲线,根据线性回归方程计算最低检测限。

1.5温度对显色反应的影响试验

在反应体系中加入不同量的MEA溶液,使终浓度为10、20、30、40、50 μmol·L-1,加入4-氨基安替比林和铁氰化钾溶液,使终浓度分别为1和2 mmol·L-1,分别于30、40、50、60、70 ℃条件下水浴20 min,稀释10倍后测定D535值,试验设置3个重复。

1.6pH对显色反应的影响试验

配制pH值为5、6、7、8、9 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PBS,20 mmol·L-1),各吸取2 mL,分别加入0.1 mol·L-1的MEA溶液150 μL,加入0.1 mol·L-14-氨基安替比林溶液和0.2 mol·L-1铁氰化钾溶液各30 μL,以磷酸盐缓冲液补足体系至3 mL,使MEA终浓度为50 μmol·L-1,稀释10倍后测定D535值,重复3次,计算标准差。

1.7化学试剂对显色反应的影响试验

以20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值为7.0)建立反应体系,加入各种金属离子,使终浓度为1 mmol·L-1,以不添加任何金属离子组作为对照,重复3次,测定含不同金属离子条件下MEA终浓度为50 μmol·L-1反应体系的D535值。

在MEA终浓度为50 μmol·L-1的20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值为7.0)反应体系中分别加入φ=10%的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙腈,φ=5%的二甲基亚砜(DMSO),φ=5%的苯甲基磺酰氟(PMSF),2 mg·mL-1十二烷基硫酸钠(SDS),20 mg·mL-1聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),20 mg·mL-1聚山梨酯-80,1 mmol·L-1CMEPA,1 mmol·L-12，6-二乙基苯胺(CDEPA),以不添加上述试剂的测定体系为对照,重复3次,稀释10倍后测定D535值。

1.84-氨基安替比林显色法检测苯胺、苯酚及其衍生物

在反应体系中加入不同量的苯胺衍生物标准液,使终浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、15、20、25、30、35、40、50 μmol·L-1,加入4-氨基安替比林和铁氰化钾溶液,使终浓度分别为1和2 mmol·L-1,重复3次,测定D535值，并获取线性方程。

1.9显色法与紫外分光光度法测定菌株T3-6粗酶液酶活性

挑取经划线活化的菌株DelftiaacidovoransT3-6单菌落接种于3 mL 液体LB试管培养基中,30 ℃条件下180 r·min-1培养菌液至对数生长期,按1%接种量接种至100 mL新鲜LB液体培养基中,30 ℃恒温条件下以180 r·min-1培养至稳定期,4 ℃条件下以5 000 r·min-1(离心半径10 cm)离心10 min,收集菌体,弃上清液;用适量预冷的20 mmol·L-1PBS (pH值为7.0)重悬菌体,4 ℃条件下以12 000 r·min-1(离心半径8 cm)离心10 min,弃上清液;以5 mL PBS重悬菌体。菌悬液以180 Hz超声波破碎10 min,整个过程在冰浴下进行,破碎液在4 ℃条件下以13 000 r·min-1(离心半径8 cm)离心20 min,上清液即为粗酶液[2]。

取适量T3-6粗酶液加至3 mL含2 mmol·L-1CMEPA的20 mmol·L-1Tris-HCl (pH值为7.0)中,于30 ℃条件下反应10 min后,加入0.1 mol·L-14-氨基安替比林和0.2 mol·L-1铁氰化钾各30 μL,重复3次,稀释10倍后测定D535值,根据标准曲线计算MEA含量。

另取等量T3-6粗酶液加至3 mL含2 mmol·L-1CMEPA的20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值为7.0)中,于30 ℃条件下反应10 min后,加入等体积二氯甲烷萃取,萃取液在284 nm波长处测定吸光度,重复3次。根据MEA在284 nm波长测定的标准曲线计算酶反应体系所产生的MEA含量,对2种方法测得的MEA含量进行比较。

2结果与分析

2.1MEA与4-氨基安替比林显色反应可见光波段扫描图谱

MEA与4-氨基安替比林在铁氰化钾催化下所形成的紫红色物质在535 nm波长处有一最大吸收峰(图1),此时吸光度为0.99,因此选取535 nm为测定吸光度时的波长。

图1　显色反应体系可见光波段扫描图谱

2.2MEA最低检测限及标准曲线

图2表明,在该反应体系中,D535值(y)与MEA浓度(x)呈良好的线性关系,回归方程为y=0.014 6x-0.005 4,R2=0.998 8。根据上述公式,当D535值为0时,MEA浓度为3.7 μmol·L-1。因此,采用该方法测定MEA含量的最低检测限为4 μmol·L-1。

图2　MEA标准曲线

2.3温度对显色反应的影响

图3表明,温度条件对显色反应有较大影响,D535值随着温度的升高而降低,且灵敏度也降低。在30、40、50、60和70 ℃条件下,D535值(y)与MEA浓度(x)之间的线性回归方程分别为:y=0.014 6x-0.005 4,y=0.010 1x+0.007 7,y=0.007 2x+0.012 6,y=0.005 3x-0.009 6,y=0.002 3x-0.027 6。

图3　温度条件对MEA标准曲线的影响

2.4pH对显色反应的影响

图4表明,以4-氨基安替比林显色法对MEA进行定量分析时,pH值对显色反应有较大影响,pH值为6～7时,所测D535值较高,碱性条件对显色反应的影响更显著。因此,在以该方法测定MEA时,应尽量在中性缓冲液条件下进行。

2.5化学试剂对显色反应的影响

图5表明,显色体系里含有1 mmol·L-1Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cr3+时,反应体系的D535值有轻微减弱,但影响并未达到显著水平,其余各离子对显色反应基本无影响。

采用邓肯氏新复极差法检验,直方柱上方英文小写字母不同表示各处理间D535差异显著(P<0.05)。

采用邓肯氏新复极差法检验,直方柱上方英文小写字母相同表示各处理间D535差异不显著(P>0.05)。

在pH值为7、MEA终浓度为50 μmol·L-1的反应体系中分别加入不同的有机试剂和CMEPA、CDEPA等底物,以不添加上述试剂的测定体系为对照,稀释10倍后测定D535,结果见表1。

不同有机试剂对显色反应的影响并不显著,在以4-氨基安替比林显色法对菌株T3-6 CMEPA水解产物MEA进行测定时,底物和有机试剂对水解产物MEA的测定无干扰作用。

2.6苯胺、苯酚及其衍生物的检测

表2表明,4-氨基安替比林显色法对苯胺、苯酚以及邻位、间位具取代基衍生物的检测都较灵敏,且具有良好的线性关系,该方法对对位具取代基的化合物不灵敏,硝基和卤素取代基对显色反应具有较大影响,2个间位同时存在取代基时,检测灵敏度也下降,而对硝基苯基乙酰胺和邻苯二酚这2种化合物不能由该方法检出。

表1不同有机试剂对显色反应的影响

Table 1Effects of chemical agents on chromogenic reaction

化学试剂 终浓度D535均值对照—0.701±0.006a甲醇100mL·L-10.684±0.010a乙醇100mL·L-10.683±0.015a丙酮100mL·L-10.681±0.017a异丙醇100mL·L-10.686±0.012a乙腈100mL·L-10.689±0.017a聚山梨酯-8020mg·mL-10.692±0.014aTritonX-10020mg·mL-10.676±0.008aSDS2mg·mL-10.681±0.006aPMSF50mL·L-10.678±0.027aDMSO50mL·L-10.683±0.016aDMF50mL·L-10.686±0.010aEDTA10mmol·L-10.680±0.024aCMEPA10mmol·L-10.697±0.010aCDEPA10mmol·L-10.696±0.008a

采用邓肯氏新复极差法检验,数据后英文小写字母相同表示各处理间D535值差异不显著(P>0.05)。“—”表示无数据。

表2苯胺、苯酚及其衍生物浓度(x)与吸光度(y)的线性方程

Table 2Linear equation of absorbancy with aniline, phenol and their derivatives

化合物稀释倍数线性方程R2苯胺10y=0.0113x+0.11360.94922,3-二甲基苯胺10y=0.0122x+0.0050.98622,4-二甲基苯胺未稀释y=0.008x-0.05150.98012,5-二甲基苯胺10y=0.0128x-0.05610.99632,6-二甲基苯胺10y=0.0095x-0.02710.99542-甲基苯胺10y=0.012x+0.0690.97244-氨基苯酚未稀释y=0.0237x-0.1730.9993苯酚10y=0.009x+0.03420.9669邻硝基苯酚10y=0.0028x+0.03240.99263-甲基苯酚10y=0.0086x+0.0260.99613,5-二甲基苯酚未稀释y=0.0187x+0.21650.96782-氨基-4-氯苯酚10y=0.0034x-0.00510.98752-氨基-5-氯苯酚10y=0.0034x+0.01570.9942

对硝基乙酰苯胺和邻苯二酚未发生显色反应。

2.72种方法测定菌株T3-6粗酶液酶活性的比较

表3表明,在用4-氨基安替比林显色法和二氯甲烷萃取-紫外分光光度法2种方法对菌株T3-6粗酶液酶活性进行测定时,所得结果无显著差异。

3结论与讨论

酰胺键的水解是CMEPA微生物降解途径中的关键反应,国内外学者在进行基因克隆时通常采用高效液相色谱(HPLC)方法检测CMEPA水解酶基因[10],但该方法不适于快速大量检测。根据MEA紫外扫描图谱,以MEA在284 nm处的吸光度(y)与其浓度(x)绘制标准曲线,线性回归方程为y=0.018 2x+0.047 4,且两者具有良好的线性关系,但这种分光光度计方法要求供检测的MEA需经过二氯甲烷萃取等步骤,相对比较繁琐。

表32种方法测定菌株T3-6粗酶液酶活性的比较

Table 3Comparison between the two methods in determination of enzymatic activity of crude extract of strain T3-6

方法吸光度重复Ⅰ重复Ⅱ重复ⅢMEA浓度/(μmol·L-1)4-氨基安替比林显色法0.4120.4010.40828.25a二氯甲烷萃取-紫外分光光度法0.5660.5870.53528.31a

采用邓肯氏新复极差法检验，数据后英文小写字母相同表示2种方法间MEA浓度差异不显著(P>0.05)。

4-氨基安替比林显色法常用于苯酚的定量分析[11-13],而苯胺及其衍生物对该反应有较大干扰,在样品中无苯酚存在的条件下,也可用于苯胺的检测[14]。在Cu2+的催化下,4-氨基安替比林与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠反应生成蓝绿色物质,可用于苯胺及相关衍生物的检测,检测限为2.1 mmol·L-1[15]。

该研究探索了4-氨基安替比林显色法定量测定MEA的影响条件。试验结果表明,在常温、pH值为中性的缓冲体系中,4-氨基安替比林与MEA、DEA、苯胺、苯酚、2-氨基和4-氯苯酚等化合物能形成较稳定的紫红色物质,在535 nm处有最大吸收峰,D535值与待检化合物浓度呈良好的线性关系。

在以4-氨基安替比林显色法测定DelftiaacidovoransT3-6 CMEPA水解酶活性时,1 mmol·L-1金属离子的存在对吸光度无显著影响,不同浓度有机试剂均对显色反应无显著影响。因此,在进行相关酶学特性试验时,也可以采用该方法进行测定。

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(责任编辑： 许素)

收稿日期：2015-08-30

基金项目：国家自然科学基金 (31560031,31570059)；江西省自然科学基金(20161BAB204178)

通信作者①E-mail: czl@njau.edu.cn

中图分类号：X592

文献标志码：A

文章编号：1673-4831(2016)04-0682-05

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.04.026

作者简介：王飞(1976—),男,湖北天门人,讲师,博士,主要从事环境微生物学研究。E-mail: wangfei179@163.com

A New Method for Determining Activity of CMEPA Hydrolase.

WANG Fei1，2， LI Zhou-kun2， DONG Wei-liang2， CUI Zhong-li2

(1.Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources/ College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2.Key Laboratory of Microbiological Engineering Agricultural Environment, Ministry of Agriculture/ College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:A new method for rapid determination of the activity of 2′-methyl-6′-ethyl-2-chloroacetanilide(CMEPA) hydrolase in Delftia acidovorans T3-6 was established. CMEPA hydrolase can hydrolyze CMEPA into 2-methyl-6-ethyl-aniline (MEA), which, in turn, reacts with 4-aminoantipyrene in 20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.0) buffer to produce a compound, purple in color, with absorbancy at 535 nm(y) positively related to the concentration of MEA(x) in the range of 10-50 μmol·L-1. The linear equation goes as y=0.014 6x-0.005 4, R2=0.998 8. The compounds of CMEPA, SDS, organic reagent such as methanol and 1 mmol·L-1metal ions have no significant effect on chromogenic reaction, whereas temperature and pH does. Compared with the dichloromethane extraction-UV spectrophotometry method, the 4-aminoantipyrene colorimetric method does not vary much in determining enzymatic activity of T3-6 crude enzyme. This method is also applicable to the determination of other derivatives of aniline and phenol.

Key words:2-methyl-6-ethyl-aniline (MEA); 4-aminoantipyrinechromogenic method; spectrophotometry; Delftia acidovorans T3-6