粟 谋 贝朝涌* 蒋林彬 徐威, 陈宁

1.桂林医学院附属医院四肢创伤骨科 541001 2.桂林医学院生物技术学院 541004

神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)在促进骨折愈合修复中是重要生长因子之一[1]。骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)是目前已成为应用较广泛的骨组织工程重要种子细胞[2，3]。基因组织工程给我们提供了良好的方法，它利用基因转染技术使得编码特定功能因子的基因转至种子细胞里或生物活性基质材料，让转染细胞表达目的基因及产物，在体内促进细胞的增殖、分化而发挥正常的生理功能。

本研究实验利用PCR方法扩增hNGF基因cDNA，构建重组质粒pcDNA3-hNGF并转染至大鼠BMSCs中，检测其表达活性。为骨折的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1试剂及材料 hNGF基因片段、TIANGEN逆转录试剂盒、无内毒素质粒大提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、限制性内切酶HindⅢ、BamHI、pcDNA3质粒载体、T4-DNA连接酶(NEB)、DH5α大肠杆菌(武汉淅玛生物技术有限公司)，DMEM(Low Glu)细胞培养基、胎牛血清(Hyclone)、DNA marker(南宁天地扬生物有限公司)，Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(invitrogen公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，ab52918NGF抗体(ABCAM公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。大鼠第5代BMSCs细胞由本课题组分离培养。

1.2方法

1.2.1真核表达载体pcDNA3-hNGF的构建及鉴定：① 引物的设计 根据GenBank公布的hNGF-cDNA。用Primer Premier 5.0软件设计引物。交由武汉淅玛生物技术有限公司合成。

上游引物: 5′-CCCAAGCTTGCCGCCACCA TGTCCATGTTGTTCTACACTCTGA -3′(含限制酶切位点HindⅢCCCAAGCTT)，

下游引物: 5′- CGCGGATCCTCAGGCTCTTCTC ACAGCCTTCCTGCTGA -3′(含限制酶切位点BamHI CGCGGATCC)。②目的基因的扩增 将hNGF基因片段按如下PCR程序扩增：预变性：94 ℃，3 min；……