孙碧徽，李荣全，段小春，常智慧

(1.北京林业大学草坪研究所，北京 100083； 2.沈阳兰溪绿化技术开发有限责任公司，辽宁 沈阳110000；3.上海绿芳景观工程有限公司，上海 201620)



多年生黑麦草叶片形态与低温胁迫的生理响应

孙碧徽1，李荣全2，段小春3，常智慧1

(1.北京林业大学草坪研究所，北京 100083； 2.沈阳兰溪绿化技术开发有限责任公司，辽宁 沈阳110000；3.上海绿芳景观工程有限公司，上海 201620)

摘要：多年生黑麦草(Lolium perenne)在冬季低温多风条件下易受寒害影响，造成脱水死亡。本研究以抗寒性强品种 ‘Brightstar SLT’和抗寒性弱品种‘Linn’为试验材料，在自然状态下观察两种黑麦草叶片形态，测定叶片相对失水速率，并在0 ℃低温胁迫条件下测定相关生理指标，以探究多年生黑麦草叶片形态与其低温胁迫生理响应的关系。结果表明,自然状态下，‘Brightstar SLT’叶片气孔数量显著多于 ‘Linn’ (P<0.05)，气孔长度、气孔面积、叶片表皮细胞和相对失水速率显著小于 ‘Linn’ (P<0.05)。低温胁迫后，两品种多年生黑麦草蒸腾速率和气孔导度在短时间内均升高，‘Brightstar SLT’蒸腾速率和气孔导度显著小于 ‘Linn’ (P<0.05)，光合速率显著高于 ‘Linn’ (P<0.05)，电解质渗透率低于‘Linn’。由此得出：抗寒品种失水速率慢，在低温胁迫条件下表现出光合能力稳定和受低温伤害程度低的特点与其气孔数目多、长度小、面积小和表皮细胞小的叶片形态紧密相关。

关键词:多年生黑麦草；叶片形态；低温胁迫；生理响应

多年生黑麦草(Loliumperenne)是一种重要的冷季型草坪草，适宜无严冬酷夏的凉爽环境，具有成坪快，能够形成致密的草坪等特点[1-3]。与其它冷季型草坪草相比，多年生黑麦草抗寒性相对较差[4]，在北方地区易受低温影响，致使其无法在冬季寒冷地区得到广泛应用[5]。

作为冷季型草坪草中抗寒性最差草种，低温胁迫极大地限制多年生黑麦草的生长。多年生黑麦草受到低温胁迫后，物质合成代谢受到抑制，水分散失，同时，低温导致细胞吸水能力下降，致使植株脱水萎蔫[6],进而死亡。因此，植株体内的水分散失量在一定程度上决定了植株在低温胁迫条件下的存活情况。而植株体水分的散失与叶片形态有关。叶片是植物体唯一完全暴露在空气中的营养器官，也是光合和蒸腾作用的主要发生地[7]，因此，叶片表面气孔与表皮细胞的大小在一定程度上决定了植株保持体内水分的能力。有关植物叶片形态与保水及抗寒能力的研究表明，结缕草(Zoysiajaponica)与假俭草(Eremochloaophiuroides)相比表皮细胞小而排列紧密，保水能力更优[8]。而在干旱地区，植物叶片越窄越有利于降低蒸腾速率，更有利于水分的保持[9]。孟庆杰等[10]研究桃(Amygdaluspersica)叶片形态和水分保持情况间的关系发现，叶片气孔密度大，叶片组织紧密，上表皮细胞小水分保持能力较强。同时，植物叶片形态与抗寒性方面也存在一定关联。在水稻(Oryzasativa)叶片上的研究表明[11]，抗寒性强的品种叶片气孔较小。白菜型冬油菜(Brassicacampestris)[12]和紫花苜蓿(Medicagosativa)[13]叶片形态与抗寒性的研究结果为抗寒性强的品种气孔密度大。而对茶树(Camelliasinensis)[14]叶片形态的研究为抗寒性差的品种气孔密度大。本研究通过对自然状态下多年生黑麦草抗寒品种‘Brightstar SLT’和不抗寒品种‘Linn’的叶片形态和低温胁迫下相关生理指标的测定，探究多年生黑麦草叶片形态与水分保持及低温胁迫条件下生理响应的关系。

1材料与方法

1.1试验材料及养护方法

供试草种选择抗寒性差异明显的两个多年生黑麦草品种：‘Brightstar SLT’( 抗寒品种)和 ‘Linn’ (不抗寒品种)[15-17]，草种由美国北达科他州立大学的李德颖教授提供。

将两品种播种于直径15 cm、高15 cm的圆盆中，基质为草炭∶蛭石∶砂(1∶1∶1)的混合物，每盆45株，置于北林科技温室内进行养护管理，温室温度25/20 ℃(日/夜)，湿度75%，光照300 μmol·m-2·s-1。每周修剪一次(留茬6 cm)并浇灌1/2Hoagland营养液以防止叶片萎蔫。

1.2试验设计

形态观察试验不进行低温处理，采用完全随机设计，2个品种每个品种设置6次重复。

低温处理采用裂区设计，主区为温度(对照试验昼夜温度15 ℃，低温处理昼夜温度0 ℃)，副区为品种，每个处理设置4次重复。

1.3处理方法

两品种在自然状态下培养两个月后进行形态观察，观测气孔密度、气孔长度、气孔面积和叶片表皮细胞大小，并测定叶片相对失水速率。

两个多年生黑麦草品种在自然状态下培养三个月后，置于昼夜15 ℃人工气候箱中稳定长势。两周后，将供试草种置于低温人工试验箱内，进行昼夜0 ℃低温胁迫处理，处理持续48 h(图1)。分别于低温处理0、1、6、24、48 h取样，测定蒸腾速率、气孔导度、光合速率和电解质渗透率，设置15 ℃为对照。

1.4取样及指标测定方法

形态指标：选取同一生长期植株主茎上完全伸展的第四片叶进行形态观察。徒手切片制作方法和石蜡切片制作方法参照李和平[18]的方法进行。切片制作完成后，由显微镜(奥林巴斯cx21)在同一视野(10×10)下进行观察。

叶片相对失水速率的测定按经改进后的Shi等[19]的方法进行；蒸腾速率、气孔导度、光合速率的测定参照董慧等[20]的方法；电解质渗透率和相对含水量测定参照李合生[21]的方法。

1.5数据处理

图片分析处理使用Image Pro Plus 6.0软件系统，数据处理使用SPSS 19.0，自然状态下多年生黑麦草自然形态及相对失水速率数据采用t检验进行统计分析，低温胁迫下多年生黑麦草生理响应数据用LSD检验作为统计分析。数据分析和制表采用EXCEL2007。

图1　试验装置模式图

注：本装置模拟冬季低温多风的环境条件。将供试植物置于低温人工试验箱内(樱花DB-2000)。在低温胁迫处理同时外施风力[空气压缩机(OST-1100)]，风速6～8 m·s-1[由风速仪(testo 410-1)测定]。在花盆空隙填充冰块作为缓冲基质，以降低温度波动幅度。外接LED冷光源，光照辐射度[hobo data logger (U12-012)测定]与对照组人工气候箱相同。

Note: The devices are used to simulate cold and windy conditions. Materials are placed in low-temperature plant growth chamber(sakura DB-2000). Cold stress interact with windy condition. Wind is produced by air compressor(OST-1100) and the speed of it is controlled within 6～8 m·s-1(measured by testo410-1). Ice, as buffering, is filled in the gap between pots to avoid fluctuation of temperature. LED cold light source is measured by hobo data logger(U12-012) and illumination intensity is identical to control.

2结果

2.1自然状态下多年生黑麦草自然形态及相对失水速率

2.1.1多年生黑麦草叶片气孔指标显微观察结果表明(表1)，两个品种叶片气孔均在叶尖分布最多，并呈现出向叶基逐渐递减的趋势。 ‘Brightstar SLT’叶尖和叶中气孔数显著多于 ‘Linn’ (P<0.05)，而叶基气孔数目无显著差异。这一结果说明，抗寒性强的品种叶尖和叶中具有更多气孔； ‘Brightstar SLT’叶尖、叶中和叶基的气孔长度显著小于 ‘Linn’ (P<0.05)，这表明抗寒性强的品种具有较小的气孔长度；在叶片中部， ‘Brightstar SLT’和 ‘Linn’气孔面积均为最大， 但‘Brightstar SLT’的气孔面积显著小于 ‘Linn’ (P<0.05)。这一结果显示，抗寒性强的品种气孔面积较小。叶片气孔各项指标比较结果说明，与抗寒性弱品种相比，抗寒性强的品种叶片气孔数多，长度小，面积小，两者气孔指标存在显著差异(P<0.05)。

表1　多年生黑麦草叶形态比较

注：叶尖指从叶尖向下3 cm内、叶中指叶片正中上下1.5 cm内，叶基指叶耳为起点向叶尖方向3 cm内。同行不同小写字母表示品种间相同指标差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Leaf apex(within 3 cm from leaf apex), leaf middle(within 1.5 cm upward and downward from the middle of the leaf) and leaf base(within 3 cm from auricle towards leaf apex).Different lower case letters within the same row indicate significant difference between two cultivars with the same parameter at the 0. 05 level. The same below.

2.1.2叶片表皮细胞大小抗寒性不同的多年生黑麦草叶片表皮细胞大小间存在差异，抗寒性强的品种叶片表皮细胞体积显著小于(P<0.05)抗寒性弱的品种。具体来看， ‘Brightstar SLT’上表皮细胞长度和宽度均显著小于‘Linn’ (P<0.05)(表2)； ‘Brightstar SLT’下表皮细胞长度显著小于‘Linn’ (P<0.05)。与抗寒性弱的品种相比，抗寒性强的品种叶片表皮细胞较小，上表皮细胞排列较紧密(图2)。

表2　多年生黑麦草叶片表皮细胞大小比较

图2　两个多年生黑麦草品种叶片解剖图

2.1.3离体叶片相对失水速率两品种离体叶片失水速率随处理时间的延长逐渐增大，抗寒性强品种失水速率小于抗寒性弱品种。‘Brightstar SLT’和‘Linn’在失水起始6 h内失水速率无显著差异(表3)。失水8 h时，‘Brightstar SLT’失水速率为32%，‘Linn’失水速率为43.3%，二者差异显著(P<0.05)，并随处理的进行始终保持这一显著性差异。结果表明,抗寒性强的品种叶片保水能力较强，在自然状态下失水较慢，能够较好地保持植株体内的水分。

2.2低温胁迫条件下多年生黑麦草生理响应

2.2.1蒸腾速率低温处理期间，两品种多年生黑麦草蒸腾速率存在波动，但整体呈现稳定趋势(表4)。低温胁迫1 h， ‘Brightstar SLT’和 ‘Linn’的蒸腾速率较对照均升高，且‘Linn’的蒸腾速率显著高于(P<0.05)‘Brightstar SLT’。在低温胁迫6和24 h，两品种多年生黑麦草蒸腾速率逐渐降低，并恢复稳定，两品种间差异不显著。与常温对照组相比，‘BrightstarSLT’和‘Linn’在1和6 h时显著高于对照组(P<0.05)，24 h后与常温对照组基本无显著差异。由此表明，与抗寒性弱品种相比，抗寒性强品种在低温胁迫下具有较强的自我调节能力，能在一定程度上降低低温逆境对机体造成的不良影响，以维持蒸腾速率稳定。

表3　多年生黑麦草离体叶片相对失水速率(%)比较

2.2.2气孔导度两品种多年生黑麦草受低温胁迫后气孔导度变化趋势与蒸腾速率相似(表5)。低温处理持续1 h时，气孔导度值均升高，但 ‘Brightstar SLT’气孔导度显著小于‘Linn’ (P<0.05)。低温胁迫6 h后，‘Brightstar SLT’和‘Linn’气孔导度差异显著性消失(P>0.05)。‘Brightstar SLT’和‘Linn’在低温胁迫1和6 h时显著高于常温对照组(P<0.05)，处理24 h后与常温对照组无显著差异。这一结果说明受外界低温胁迫后，抗寒性强的品种具有较强的自我调节能力，使气孔导度维持稳定，降低外界对机体的伤害。

2.2.3光合速率低温胁迫期间， ‘Linn’和 ‘Brightstar SLT’光合速率整体呈下降趋势，对照组光合速率也呈下降趋势(表6)。低温胁迫1 h，‘Brightstar SLT’和‘Linn’光合速率均升高。在6和24 h时，两品种多年生黑麦草光合速率逐渐下降，但品种间差异不显著(P>0.05)。在48 h时，‘Brightstar SLT’光合速率保持稳定，‘Linn’光合速率降低，前者显著高于后者(P<0.05)。常温对照组光合速率基本保持不变，但在1 h时光合速率下降明显，‘Linn’在低温胁迫处理48 h时与常温对照差异显著(P<0.05)。由此可见，两种多年生黑麦草受低温胁迫后，短时间内光合增强，且抗寒性强的品种光合速率大于抗寒性弱的品种，随低温处理的进行，光合速率降低，抗寒性强的品种光合速率降低程度小于抗寒性弱的品种。这表明，相较于抗寒性弱的品种，抗寒性强品种在低温条件下维持光合速率，进行光合作用的能力强。

2.2.4电解质渗透随低温胁迫的持续进行，‘Linn’和‘Brightstar SLT’的电解质渗透率呈现增大趋势(表7)。低温胁迫6h，‘BrightstarSLT’和‘Linn’电解质渗透率无显著差异(P>0.05)。而在低温胁迫进行24 h时，两者电解质渗透率差异显著(P<0.05)。48 h时，‘Linn’电解质渗透率为25.4%,‘Brightstar SLT’电解质渗透率为19.02%，二者差异不显著。与对照组相比，低温胁迫0和1 h，‘Brightstar SLT’和‘Linn’电解质渗透率与对照组无显著差异，低温胁迫处理6 h后，处理组电解质渗透率与对照组差异显著(P<0.05)。由此表明,低温胁迫条件下，两品种多年生黑麦草膜系统均遭到一定程度破坏，但抗寒性强的品种在胁迫过程中保持膜完整性能力更强。

表4　低温胁迫对多年生黑麦草叶片蒸腾速率(mmol·m-2·s-1)的影响

表5　低温胁迫对多年生黑麦草叶片气孔导度(mol·m-2·s-1)的影响

表6　低温胁迫对多年生黑麦草叶片光合速率(μmol·m-2·s-1)的影响

表7　低温胁迫对多年生黑麦草电解质渗透率(%)的影响

3讨论与结论

3.1形态结构

本研究发现，多年生黑麦草抗寒性强的品种‘Brightstar SLT’气孔数目多、长度小且面积小，而抗寒性弱的品种‘Linn’叶片气孔数目少，长度大并且气孔面积大。赵跃龙和罗玉英[11]研究水稻品种抗寒性与形态的相关关系结果表明，抗寒性强的品种气孔小，抗寒性差的品种气孔大，有关冬油菜的研究也得到相同的结果[22]，这与本研究得到的结果一致。表皮细胞是叶片表皮的主要组成部分。本研究中， 品种‘Brightstar SLT’表皮细胞较小，排列紧密，而品种‘Linn’表皮细胞大。这不同于菊花(Chrysanthemun)[23]、小香水梨和山梨(Pyrusussuriensis)[24]抗寒品种叶表皮厚的研究结果，但与秘鲁番荔枝(Annonacherimola)的研究结果一致[25]。这可能是由于不同植物生长环境生理特性不同而造成叶片形态不同。同时，在自然状态下，‘Brightstar SLT’离体叶片相对失水速率小于 ‘Linn’。叶片的主要功能是进行光合和蒸腾作用，水分可以通过叶片向外散失，而气孔是控制叶片内外水分蒸腾和CO2扩散的门户[26]。小而多的气孔可以使蒸腾更有效，使气孔开度调节更灵活，从而有效降低水分散失[27]。而气孔的蒸腾与气孔周长成正比，因此，抗寒性强品种小而多的气孔能够使蒸腾更加有效，使气孔开度调节更加灵活[27]。 表皮细胞较小且排列紧密这一形态特征可以有效降低失水速率，保持植株体内水分。同时，表皮细胞小与气孔小这两者共同作用，在低温胁迫条件下，使水分经较短的距离运出细胞，防止造成细胞内结冰[11]。这些结果表明,多年生黑麦草抗寒性与叶片形态之间存在紧密关联。

3.2生理响应

多年生黑麦草在低温胁迫下，光合活性下降，光合作用受到抑制，同时细胞膜结构受破坏，膜透性增加，进而发生一些列的生理生化变化[28]。本研究模拟冬季气候条件，为供试草种人为营造了低温多风的环境。结果显示，低温胁迫使两品种多年生黑麦草蒸腾速率和气孔导度在短时间内显著升高(P<0.05)，抗寒性强的品种蒸腾速率和气孔导度均小于抗寒性弱的品种。受低温胁迫后，两品种光合速率降低， ‘Brightstar SLT’的光合速率高于 ‘Linn’。这与耐寒的夏威夷草(Paspalumvaginatum)和假俭草5号(Eremochloaophiuroides)光合速率受低温抑制作用小[29]的研究结果一致。Okawara和Kaneko[30-31]的研究同样表明，结缕草在低温环境中会发生光抑制而使得光系统Ⅱ受到抑制。随低温胁迫处理的进行，两品种多年生黑麦草‘Brightstar SLT’和‘Linn’电解质渗透率均增大，这与在‘优异’(Poapratensiscv. Merit)等3种冷季型草坪草[28]和沟叶结缕草(Zoysiamatrella)等暖季型草坪草[32-33]上进行的低温研究结果一致。抗寒性强品种在低温胁迫过程中可以通过小而多的气孔灵活的调节气孔开度，保持蒸腾速率和气孔导度的稳定并将光合速率的维持在一定的水平。稳定的光合速率有利于光合产物在低温胁迫条件下进行积累，维持植株体正常的代谢，进而保持细胞膜结构的的完整性，减少细胞的损伤。因此，抗寒性强品种‘Brightstar SLT’在低温胁迫条件下蒸腾速率和气孔导度低于‘Linn’，并且光合速率稳定，这可能与其叶片气孔数目多、长度短且面积小有关。

综上所述，抗寒性强品种的叶片形态、失水速率慢，以及在低温胁迫条件下表现出光合能力稳定与受低温伤害程度低紧密相关。抗寒性强品种叶片具有气孔数目多、长度短、面积小、表皮细胞小的特征。这些形态特征有利于多年生黑麦草在低温胁迫后通过调节叶片表皮气孔开闭，减小蒸腾速率和气孔导度的大幅变化，减少水分的散失。同时，这一形态特征可以维持光合速率的稳定，保护自身光系统，有利于抗寒性强品种在低温胁迫条件下积累光合产物，提供能量物质修复低温胁迫造成的伤害。本研究只对叶片形态结构与低温条件下生理响应进行了研究分析，在今后的试验中可以对多年生黑麦草植株形态综合因素与低温胁迫生理响应间的关系进行深入探究，进一步定量测定光合产物的积累情况，并测定光和产物的种类。

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(责任编辑张瑾)

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0430

*收稿日期：2015-08-06接受日期：2015-11-03

基金项目：北京高等学校“青年英才计划”项目( YETP0742)

通信作者：常智慧(1978-)，男(土家族)，湖北咸丰人，副教授，博士，主要从事草坪草耐性生理方向的研究。Email: changzh@bjfu.edu.cn

中图分类号：S543+.604;Q945.78

文献标识码：A

文章编号：1001-0629(2016)3-0450-09* 1

Corresponding author:Chang Zhi-huiE-mail: changzh@bjfu.edu.cn

Relationship between leaf morphology and physiological responses of perennial ryegrass under cold stress

Sun Bi-hui1, Li Rong-quan2, Duan Xiao-chun3, Chang Zhi-hui1

(1.Turfgrass Institute of Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;2.Landscaping Technology Development Limited Liability Company of Lanxi, Shenyang 110000, China;3.Shanghai Lvfang Landscape Engineering Co., LTD, Shanghai 201620, China)

Abstract:Perennial ryegrass(Lolium perenne) is susceptible to cold and windy condition in winter, which results in dehydration and death. In order to explore the relationship between leaf morphology and physiological changes of perennial ryegrass under cold stress, leaf morphology, relative water loss rate of detached leaves and some physiological indices under cold stress 0 ℃ of cultivar ‘Brightstar SLT’ (freezing-tolerant) and ‘Linn’ (freezing-sensitive) were measured. Under natural condition, the stomatal number of ‘Brightstar SLT’ was significantly higher than (P<0.05) that of ‘Linn’, whereas stomatal length, stomatal area, leaf epidermal cell and leaf relative water loss of ‘Brightstar SLT’ were significantly lower than (P<0.05) those of ‘Linn’. Under cold stress, transpiration rate and stomatal conductance of both perennial ryegrass cultivars increased in a short time, however, those of the ‘Brightstar SLT’ were significantly lower (P<0.05) than those of ‘Linn’. In addition, the photosynthetic rate of ‘Brightstar SLT’ was significantly higher (P<0.05) than that of ‘Linn’， whereas electrolyte leakage of ‘Brightstar SLT’ was lower than that of ‘Linn’. In conclusion, there was a close correlation between lower water loss rate along with better performance under cold stress (including stable photosynthesis ability and less cold injury) and leaf morphology (including larger quantity of stoma, shorter stomatal length, smaller stomatal size and smaller leaf epidermal cell) in freezing-tolerant cultivar.

Key words:perennial ryegrass; leaf morphology; cold stress; physiological responses

孙碧徽,李荣全,段小春,常智慧.多年生黑麦草叶片形态与低温胁迫的生理响应.草业科学,2016,33(3)：450-458.

Sun B H,Li R Q,Duan X C,Chang Z H.Relationship between leaf morphology and physiological responses of perennial ryegrass under cold stress.Pratacultural Science，2016,33(3)：450-458.

第一作者：孙碧徽(1990-)，女，辽宁丹东人，在读硕士生，主要从事多年生黑麦草抗寒性方面的研究。Email:michbforever@sina.com