姚延珠，吴明明，孙金海

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

姚延珠1，吴明明2，孙金海1

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193）

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-Ⅰ基因的双基因共表达载体，制备转双基因（pGH+IGF-Ⅰ）猪，以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因对猪生长发育的影响，为节粮型高瘦肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA，经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-Ⅰ基因完整的编码序列，经酶切连接克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体上，构建pcDNA3.1（+）-pGH-IGF-Ⅰ双基因共表达载体。将其转染PK15细胞，Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子，采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体，Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH基因和IGF-Ⅰ基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明，成功克隆了长白猪的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体，转染PK15细胞后，Q-PCR检测表明，pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪，经PCR及测序检测，其中4头仔猪为转双基因阳性，转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因在转双基因猪体内成功表达。1～7月龄均可检测到外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因，证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在，并未随着生长而丢失。……