张和平，宗玉霞，王李辉

(河南省平顶山市动物疫病预防控制中心，河南 平顶山 467000)



不同凝集方法对畜间布鲁氏菌检测的影响

张和平，宗玉霞，王李辉

(河南省平顶山市动物疫病预防控制中心，河南 平顶山 467000)

摘要：为探求适合不同检验需求的布氏菌病的检测方法，在实验条件完全相同的情况下，将198份布氏菌试管凝集试验阳性血清，同时进行三种不同试管凝集试验和微量凝集试验。结果显示4种检验方法稳定性均较好，建议根据环境条件和样本数量选择相应的检测方法，运用于畜间布氏菌病监测和诊断。可大幅度提高检测效率。

关键词：布鲁氏杆菌；试管凝集试验；微量凝集试验

布鲁氏杆菌病(简称布病)是由布鲁氏杆菌属的细菌侵入机体，引起的人兽共患的乙类传染病[1]。布鲁氏杆菌病常用的血清学方法包括平板凝集试验、虎红平板凝集试验、试管凝集试验、抗球蛋白试验、补体结合试验和间接酶联免疫吸附试验等。平顶山市畜间布病监测过程中，初次筛选采用虎红平板凝集试验，然后检出的阳性样品利用试管凝集试验进行最终定性。试管凝集试验以其特异性和敏感性用以布病的确诊，然而由于活畜交易频度、数量的增加和检疫、监测过程中样本数量庞大，进行大量样本检测时费时、费力等因素，需找到适合不同要求的检测方法进行确诊。现对试管凝集试验的三种不同方法和微量法进行了比较研究，以期寻找到适合不同检验需求的快速、特异、敏感、简易及便于推广应用的布病诊断方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集

样品来源于平顶山五县六区(叶县、鲁山、宝丰、舞钢、郏县、石龙区、新华区、卫东区、高新区、新城区和湛河区等)监测过程中的198份羊血清阳性样品。

1.1.2器材与试剂

布病试管凝集试验抗原(哈药集团生物疫苗有限公司)；阳性血清(哈药集团生物疫苗有限公司)；阴性血清(哈药集团生物疫苗有限公司)；其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1传统试管凝集试验(SAT)

每份被检血清准备5支小试管，用吸管在第1管加入2.3mL稀释液，第2管不加，第3管、第4管、第5管各加入稀释液0.5mL，用1mL吸管吸取被检血清0.2mL加入第一管中，并混匀后吸取0.5mL加入第2管中和第三管中，充分混匀第三管，从第3管中取0.5mL加入第4管，以此类推至第5管，从第5管吸取0.5mL弃去。然后，第1管不加抗原，在2管～5管中各加入20倍稀释的试管凝集抗原0.5mL，每管反应体积均为1mL。血清稀释度从1管～5管为1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100和1∶200，同时设置阴性血清对照和阳性血清对照，配制比浊管，混匀后37℃孵育24h[2]。

1.2.2改良的试管凝集试验

每份被检血清用4支试管盛装，标记检验编号后用移液器在第1管加1.15mL稀释液，第2～4管各加人0.5mL稀释液。取被检血清0.1mL加入第1管中，充分混匀后吸弃0.25mL。从第1管中吸取0.5mL加入到第2管中，混匀后再从第2管吸取0.5mL加至第3管中，倍比稀释至第4管，从第4管弃去0.5mL，稀释完毕。将0.5mL抗原(1∶20)加入已稀释好的各血清试管中，并振摇均匀，同时设置阴性血清对照和阳性血清对照，配制比浊管，混匀后37℃孵育24h[3]。

1.2.3水浴法试管凝集试验

每份被检血清用4支试管盛装，标记检验编号后用移液器在第1管加1.15mL稀释液，第2～4管各加人0.5mL稀释液。取被检血清0.1mL加入第1管中，充分混匀后吸弃0.25mL。从第1管中吸取0.5mL加入到第2管中，混匀均匀后再从第2管吸取0.5mL加至第3管中，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去0.5mL，稀释完毕。将0.5mL抗原(1∶20)加入已稀释好的各血清试管中，并振摇均匀，同时设置阴性血清对照和阳性血清对照，配制比浊管，加抗原后充分混匀，52℃3～5min水浴，振荡2～4次，1500r/min离心机中离心5min，判定结果同常规SAT法[4]。

1.2.4微量法凝集试验(MAT)

使用96孔一次性U型反应板，每1列为1份样本。A1～A12行各孔中用微量移液器加入96uL稀释液，其余各孔加入50uL。分别加待检血清4uL加入到A1～A12行各孔中。移液器调50uL，从A行开始，同时将12份标本倍比稀释到H行，弃去50uL。每孔中加入50uL稀释好的布鲁氏菌凝集抗原，轻轻震荡混匀后，加盖板，放入温箱。反应温度和时间与SAT相同。最终稀释度从A行到H行为1∶50～1∶6400。结果判定，在黑色背景下进行观察，以50%凝集的最高稀释度作为终点。

2结果

表1　阳性布病血清的不同检测方法结果比较

由表1可以看出，与常规SAT方法相比，改良SAT法提高了布鲁氏菌阳性血清的检出率。水浴法和MAT法检出阳性血清的能力低于SAT法，符合率分别为89.64%和95.85%，利用SPSS 13.0对结果数据进行分析发现P>0.05，可见水浴法和MAT法两种检测方法与常规SAT法相比差异不显著。

3讨论

近年来布病疫情呈现回升的趋势[5-6]，危害十分严重。监测检验在布病的综合性防控措施中起着重要作用。血清学检验是布鲁氏杆菌病诊断的常用方法，但是随着实验室的基本操作仪器的更新换代和检测数量的增加，传统的实验方法需要进一步改进。

研究表明常规SAT和改良SAT法检测的阳性符合率达到101.55%，这说明改良的SAT法的稳定性及检出率均较好。由于使用微量移液器代替吸管，同时改良加样方案，可以使加液和加样更加精确，从而减小误差。用移液器还可以避免因血清亮较少无法进行试验等问题，同时移液器可以随时更换吸头，可以避免洗涤、消毒和干燥等一系列繁琐的操作，减少劳动强度，提高工作效率。水浴法SAT的阳性检测值比上述两种方法较少，但是同常规SAT法相比，其符合率达到89.64%，表明水浴法可以用于布病的检验检疫中。与上述两种SAT法相比，水浴法可以节省很多时间，并且可以节省购买恒温箱的开支。MAT法检测阳性血清的能力MAT的优点在于使用精密的微量移液器，在检测样本数量较大时可以大大提高检测效率。

通过对198份阳性血清的检测，表明改良SAT、水浴法SAT法和MAT法均非常稳定，建议在畜间布病的监测、检验中，实验条件允许下使用改良SAT法代替常规SAT，以提高检测的准确率。日常监测过程中检测样本数量较大时，可选择MAT法以减少繁琐步骤和工作量。而在时间紧急和一些基层兽医站或野外田间操作时可以使用水浴SAT法。

参考文献：

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].北京:中国农业出版社,2013:3.

[2] GB15988-1995，布鲁氏菌病诊断标准及处理原则[S].

[3] GB/T18646-2002，动物布鲁氏菌病诊断技术[S].

[4] 张双宅,赵冬,刘维华，等.布氏菌凝集试验试管法和微量法的比较[J].中国地方病防治杂志,2008,23(3):174-175.

[5] 王晓晶.布病“抬头”，农业部迅速行动布控-对症下药严防疫情蔓延暴发[J].中国畜牧兽医文摘，2010(4)：10-11.

[6] 张华菊，宗玉霞，王李辉，等.平顶山市羊布病流行病学调查和防控策略[J].黑龙江畜牧兽医,2015(484):105-107.

收稿日期:2016-02-17修回日期：2016-05-17

作者简介：张和平(1965-)，男，本科，高级兽医师。

doi:10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.07.005

中图分类号：S855

文献标识码：A

文章编号：2095-9737(2016)07-0008-01