王婷婷　何爱娟　刘豫　曹谊林　唐胜建　周广东

·论著·

骨髓基质干细胞扩增体系研究

王婷婷何爱娟刘豫曹谊林唐胜建周广东

【摘要】目的比较三种不同培养体系对人骨髓基质干细胞（hBMSCs）增殖能力、表面标志和分化潜能的影响，探索hBMSCs适合的培养体系。方法获取hBMSCs，分别用DMEM、DMEM+碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和无动物组份的间充质干细胞培养基（Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free，MSCM-acf）进行培养，反复传代至第6代，分别计数每种培养体系每个代次的细胞得率。取第4～6代细胞，用流式细胞仪对细胞表面标志进行检测，同时对各组第6代细胞分别向成软骨、成脂和成骨方向进行诱导分化。结果培养至第2代后，MSCM-acf培养体系细胞得率显著大于其他两组；流式细胞分析结果表明，MSCM-acf培养体系表面阳性标志CD73、CD90和CD105均大于99%，总的阴性标志表达小于2%，优于其他两组，尤其是DMEM+bFGF培养体系；三组均保留了多向分化潜能，添加bFGF的培养体系成软骨分化明显优于其他两组，MSCM-acf培养体系成脂和成骨分化优于其他两组。结论MSCM-acf培养体系可以实现hBMSCs干性维持下的大量扩增，是hBMSCs较为理想的培养体系。

【关键词】骨髓基质干细胞培养体系细胞表面标志分化潜能

人骨髓基质干细胞（hBMSCs）取材创伤小，可以进行体外扩增，不易变异，且具有多向分化潜能，抗原性小，修复能力强等优点，是组织工程非常有应用前景的种子细胞[1]。但是，hBMSCs体外大量扩增易发生老化及自发分化[2]，其干细胞相关表面标志物受不同培养体系的影响也会发生很大变化，进而影响其干性及多向分化潜能[3-4]。因此，实现干性维持前提下的大量扩增，是hBMSCs研究及临床应用转化所面临的关键问题[5]。

目前，已报道的不同培养体系对hBMSCs扩增培养和分化潜能有很大影响[6]。常用的hBMSCs培养扩增体系主要是基于DMEM添加胎牛血清（FBS）的培养体系，受胎牛血清复杂成分的影响[7]，易出现自发分化，丧失干性及多向分化潜能，且多次传代扩增后增殖能力显著下降。此外，由于胎牛血清中异种蛋白的存在，使其在临床应用中存在局限性[8]。研究证实，在培养体系中添加bFGF可实现hBMSCs大量扩增，并保留其一定的干性及多向分化潜能。但也有研究表明，bFGF对hBMSCs干细胞相关表面标志有显著影响，如显著降低CD90和CD105的表达[4]，而且含bFGF的培养体系仍有胎牛血清成分。

无血清培养体系组成明确，不含胎牛血清成分，无异种蛋白影响，培养体系不同批次成分稳定，可重复性强。我们前期研究发现，无血清培养体系MSCM-acf可促进hBMSCs的大量扩增，但对于细胞表面标志和分化潜能的影响尚无系统的研究。

本实验旨在探讨MSCM-acf无血清培养体系在细胞得率、表面标志的表达水平和分化潜能方面是否具有明显优势。

1　材料和方法

1.1临床资料、试剂与仪器

骨髓取自上海第六人民医院行髋关节置换手术的患者，共9例，每例5 mL。患者平均年龄（50±5）岁。所有患者对实验知情同意，并签署知情同意书。

DMEM，0.25%胰酶（Gibco公司，美国）；胎牛血清，磷酸盐缓冲液（Hyclone公司，美国）；bFGF，Human MSC Analysis Kit，流式细胞仪（B&D公司，美国）MSCM-acf（ScienCell，美国）；油红O染液、甲苯胺蓝染液、茜素红染液（武汉谷歌生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1实验分组

对照组1：DMEM培养体系 （含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL）；对照组2：DMEM+ bFGF培养体系（含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL，bFGF 5 ng/mL）；实验组：MSCM-acf培养体系。

1.2.2hBMSCs培养

标本离心管中加入含10%FBS的DMEM培养液40 mL，混匀制成细胞悬液，1 900 r/min离心8 min，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，振荡，细胞重悬，接种于100 mm培养皿，置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下培养，5 d后首次换液，待细胞80%融合时，0.25%胰酶消化，收集细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，计数，分别用三种培养液重悬，按0.5×106个有核细胞接种于100 mm培养皿。2～3 d可达到80% ～90%的融合度，再次传代培养。每次传代时观察细胞形态变化，并计数细胞得率。

1.2.3流式细胞检测hBMSCs表面标志

分别取三个培养体系的第4～6代hBMSCs，0.25%胰酶消化，离心，用缓冲液重悬，计数调整细胞浓度为2×106cells/mL，按照Human MSC Analysis Kit说明，取100 μL细胞悬液分别与CD90、CD73、CD105、CD34、CD45、CD11b和HLA-DR单克隆抗体室温避光孵育30 min，缓冲液洗涤3遍，每种样品重悬成300 μL，待上机。

1.2.4hBMSCs的诱导分化

分别取三个培养体系的第6代细胞，向成软骨、成脂和成骨方向进行诱导分化。3周后分别用甲苯胺蓝、油红O和茜素红染色。

2　结果

2.1三组培养体系中hBMSCs的形态变化

光镜下观察到对照组1细胞生长较为缓慢、稀疏，细胞胞体较大，凸起较为明显；对照组2的细胞低代次胞体较小，随代次增加呈长梭型改变，边缘较锐利；实验组细胞比对照组1的低代次细胞体积更小，成多角形，而且随传代次数增加，细胞凸起增多，凸起较短。表明MSCM-acf培养体系能更好地维持hBMSCs的细胞形态（图1）。

2.2hBMSCs细胞得率

本实验中hBMSCs的扩增基数均为0.5×106个有核细胞，各组前两代细胞扩增无明显差异。第3～6代中，实验组、对照组2细胞得率均高于对照组1。第6代时，实验组细胞得率平均达到230×106个，远高于对照组2（110×106个）。表明MSCM-acf培养体系在保持细胞良好形态的同时，显著促进细胞增殖（图2）。

2.3hBMSCs表面标志检测

经流式细胞仪检测，实验组hBMSCs表面阳性标记物CD90、CD73和CD105的表达程度均>99%，CD45、CD11b和HLA-DR等阴性标志物的表达总数<2%，明显优于对照组。实验组2阳性标记物CD90 和CD105的表达明显低于实验组1，两组CD73的表达没有差别；而阴性标志物的表达实验组2远大于实验组1，且两组均>2%。表明MSCM-acf培养体系能更好地维持hBMSCs的干性（图3-4）。

2.4hBMSCs的诱导分化

2.4.1成软骨分化

hBMSCs成软骨分化3周后，甲苯胺蓝染色显示三组细胞核均蓝染，对照组2染色偏深。表明三组培养体系均保留成软骨分化潜能，对照组2成软骨能力比其他两组强（图5）。

2.4.2成脂分化

hBMSCs成脂诱导3周后，三组细胞逐渐由长梭形变成多边形、椭圆形等脂肪样细胞形态，停止生长，细胞中均出现脂肪颗粒，油红O染色显示三组均呈现橘红色脂滴。对照组1、2间无明显差异，但脂滴较小，数目较少。单个细胞中，实验组脂滴颗粒比对照组多，且体积明显增大。表明MSCM-acf培养体系能更好地促进成脂分化（图5）。

2.4.3成骨分化

成骨诱导3周后，三组细胞均聚集成团，有结晶样物质出现，茜素红染色均呈现红色钙结节。实验组呈现大量钙结节，对照组1、2钙结节不明显。表明MSCM-acf培养体系可更好地促进成骨分化（图5）。

图1　hBMSCs在三种培养体系连续传代培养下的形态观察（40×）Fig.1　Morphological observation of hBMSCs under successively passaged culture in three expansion systems(40×)

图2　hBMSCs在三组培养体系中的细胞得率Fig.2 Cell yield of hBMSCs in three expansion systems

图3　第4～6代hBMSCs在三组培养体系中的CD90、CD105、CD73和所有阴性标志的表达百分比Fig.3　The percentage of fluorescence of CD90,CD105,CD73 and all the negative cocktails of P4-P6 hBMSCs in three expansion systems

图4MSCM-acf培养体系中第6代hBMSCs表面标志物的表达Fig.4　The cell surface marker expression profile of P6 hBMSCs with expansion system of MSCM-acf

图5　三种培养体系中第6代hBMSCs分别诱导成软骨、成脂和成骨分化（100×）Fig.5　Chondrogenic differentiation,adipogenic differentiation and osteogenic differentiation of P6 hBMSCs in three expansion culture conditions(100×)

3　讨论

hBMSCs是组织工程与再生医学领域最具应用前景的种子细胞之一[9-10]。如何在维持干性的前提下大量扩增，是制约其发展与应用的重要问题[11-13]。研究表明，MSCM-acf培养体系能有效地实现hBMSCs大量扩增，扩增细胞稳定表达干细胞相关表面标志，且保留了良好的软骨、脂肪、骨多向分化潜能，细胞得率和干性维持显著，优于传统的含血清培养体系及基于bFGF的扩增体系。提示MSCM-acf是一种具有临床应用前景的hBMSCs培养扩增体系。

本实验结果表明，在MSCM-acf培养体系中，第2代后的细胞得率均大于传统含血清的DMEM培养体系和基于bFGF的扩增体系。第1、2代三个培养体系的细胞得率无明显差异，可能是低代次的细胞干性较好，受培养体系的影响小。自第2代起，细胞在无血清培养体系中的增殖明显高于其他两组，第6代细胞得率平均达到230×106个，且传代后细胞形态未发生明显变化。可能是在这种培养体系中，添加了类似血清替代品或bFGF等促细胞增殖的一系列因子，无异源蛋白成分，加之这种培养液成分固定，可以稳定维持细胞的干性。我们的前期研究发现，不同批号甚至同一批号不同批次的血清成分不稳定，使得DMEM培养体系易受血清的影响，而发生老化和自发分化，从而减弱细胞的增殖能力。DMEM+bFGF培养体系虽然添加了bFGF，可刺激细胞增殖，但成分单一，无法满足细胞大量扩增需要。

hBMSCs干细胞相关表面标志的表达是反应干性的重要指标，表达水平对于细胞维持多向分化潜能有很大影响[3-4]。影响细胞表面标志表达的因素是多方面的，其中血清是一个很重要的影响因素，因其成分复杂，不可控，不能稳定维持细胞的干性，进而影响细胞表面标志的表达。本实验应用的无血清培养体系MSCM-acf可实现细胞表面标志稳定均一表达，阳性标志CD90、CD105和CD73表达均达到99%以上，所有阴性指标的表达总数<2%，并且代次间无明显变化。该结果符合MSCs定义的最低标准：表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b和HLA-DR[9，14]。而DMEM培养体系达不到上述标准，尤其是添加 bFGF后，CD90和CD105的表达明显下调，阴性标志的表达总数平均达到40%。本实验结果与文献报道一致[3]。

hBMSCs多向分化潜能是反应其干性的另一重要指标。在MSCM-acf培养体系中，成脂分化，脂滴的数目更多，体积更大；成骨分化，钙结节更多；成脂和成骨分化优于含血清的DMEM培养体系。DMEM+bFGF培养体系成软骨分化较为明显，这一结果同样与文献报道一致[3]；DMEM培养体系中，由于细胞干性的逐步丧失，因此失去了良好的分化潜能。这一结果表明，细胞在无血清培养体系中可以更好地维持细胞的干性，进而稳定维持其分化潜能。

综上所述，无血清培养体系MSCM-acf能长期维持hBMSCs的干性并大量快速扩增，同时使细胞表面标志高度均一表达，解决了细胞表面标志不稳定表达的难题，也充分维持了细胞多向分化的潜能。因此，MSCM-acf是hBMSCs较为理想的培养体系。

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·论著·

【中图分类号】Q813.1+1

【文献标识码】A

【文章编号】1673－0364（2016）03－0152－05

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.002

作者单位：261042山东省潍坊市潍坊医学院整形外科研究所（王婷婷，唐胜建，周广东）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室（王婷婷，何爱娟，刘豫，曹谊林，周广东）；200241上海市组织工程国家工程研究中心（王婷婷，何爱娟，刘豫，曹谊林，周广东）。

通讯作者：周广东（E-mail：guangdongzhou@126.com）。

收稿日期：（2016年2月26日；修回日期：2016年4月19日）

Research on the Amplification System of Bone Marrow Stromal Stem Cells

WANG Tingting1,2,3,HE Aijuan2,3,LIU Yu2,3,CAO Yilin2,3,TANG Shengjian1,ZHOU Guangdong1,2,3.1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College, Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail: guangdongzhou@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo compare the effects of three different culture systems on the proliferation ability,surface marker and differentiation potential of bone marrow stromal stem cells(hBMSCs),and to explore a suitable expansion system for hBMSCs.MethodshBMSCs were obtained and cultured respectively in three culture systems:DMEM,DMEM+basic fibroblast growth factor(bFGF)and Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free(MSCM-acf),to the sixth generation of repeated passages.The cell yield of each culture system for each rate was counted.Cell surface markers of P4-P6 were detected using flow cytometry.At the same time,hBMSCs of P6 in each culture system were induced for chondrogenic differentiation,osteogenic differentiation and adipogenic differentiation.ResultsThe cell yield in MSCM-acf group was far greater than that of the other two groups;The positive indicators of hBMSCs were detected by flow cytometry, in MSCM-acf group,CD73,CD90 and CD105 were all greater than 99%,the sum of negative cocktails was lower than 2%, which showed better results compared with the other two groups,especially DMEM+bFGF group.All of the three groups had the potential of differentiation.Cartilage differentiation in DMEM+bFGF was better.Adipogenic differentiation and osteogenic differentiation in MSCM-acf group were better than the other two expansion systems.ConclusionMSCM-acf expansion system can achieve a large number of hBMSCs amplification,and maintain the activity of cells.Therefore,MSCM-acf can be considered as an ideal hBMSCs expansion system.

【Key words】Bone marrow stromal stem cells;Expansion system;Surface marker;Differentiative potential