吴迪，赵颖，任会丹，司新红，张琳，王澈,2Δ

(1.辽宁师范大学 化学与化工学院，辽宁 大连 116029；2.辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

阳离子抗癌肽Temporin-1CEa脂质体的构建及其体外抗乳腺癌活性评价

吴迪1†，赵颖1†，任会丹1，司新红1，张琳1，王澈1,2Δ

(1.辽宁师范大学 化学与化工学院，辽宁 大连 116029；2.辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的 建立阳离子抗癌肽Temporin-1CEa药物载体系统，并评价其体外抗乳腺癌活性。方法 本文选用阳离子抗癌肽Temporin-1CEa利用逆向蒸发法构建聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰的脂质体(Temporion-1CEa-liposomes, Temporin-1CEa-LIP)，并对其包封率、粒径和Zeta电位进行表征，同时对其体外血清稳定性及其对人乳腺癌MCF-7细胞的体外活细胞毒性进行初步评价。结果 采用逆向蒸发法制备PEG修饰的Temporin-1CEa-LIP，其包封率为(55.57±1.56)%，粒径为(105.3±1.37)nm，Zeta电位为(-16.17±0.964)mV。Temporin-1CEa-LIP具有良好的血清稳定性，能够被人乳腺癌MCF-7细胞有效摄取，并在作用细胞24 h后与Temporin-1CEa具有相近的抑癌活性。结论 PEG修饰的脂质体是一种很好的新型多肽类抗癌药物递送系统，Temporin-1CEa-LIP有望成为新型的抗癌制剂用于临床。

抗癌肽；乳腺癌；脂质体；聚乙二醇

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康[1]。传统化疗药物由于靶向性差和多药耐药现象的发生，往往导致乳腺癌临床疗效欠佳甚至治疗失败[2]。近年来，随着对肽类抗癌药物研究的不断深入，发现某些阳离子抗癌肽(cationic anticancer peptide，CAPs)具有独特的作用机制和良好的抑癌作用，且不易产生耐药性，因此逐渐成为目前新型抗癌药物研究的热点。但是由于阳离子抗癌肽在体内易水解，稳定性较差等不足限制了其临床使用。对阳离子抗癌肽进行药学修饰并建立药物载体系统以克服上述缺点并促进其临床转化已经成为目前亟待解决的问题。

CAPs分子量较小，带有正电荷，对肿瘤细胞有较好的选择性[3-4]。与正常非肿瘤细胞相比，肿瘤细胞的细胞膜表面通常带有较多的负电荷，CAP能够通过静电作用结合到肿瘤细胞的细胞膜上，从而达到靶向性的抗癌作用[5]。本文选取的Temporin-1CEa是从中国林蛙皮肤分泌物中提取的的天然CAP，由17个氨基酸组成，带3个净正电荷。本课题组已经证明Temporin-1CEa具有良好的选择性抗癌作用，能有效杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞无明显毒副作用[6-7]。但是CAPs无论是口服或是静脉注射，在体内均具有易水解、稳定性较差等性质，所以迫切需要借助药物载体将CAPs运输到体内避免其水解破坏，使其稳定的靶向地作用于肿瘤，从而达到治疗的效果[8-10]。

在众多载药系统中，脂质体是最先应用于临床的药物载体，主要由天然成分组成，具有良好的相容性和靶向性，且体内降解无毒性[11]。聚乙二醇(polyethylene glycols，PEG)可以显著延长药物载体在体内的循环时间，PEG修饰的脂质体不易被体内网状内皮系统作为异物吞噬、清除，并且能够通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention, EPR)[12-14]，将药物有效地靶向肿瘤部位发挥治疗作用。

本实验旨在构建PEG-脂质体药物载体系统，在保留抗癌肽Temporin-1CEa良好的抑癌效果的基础上，改善Temporin-1CEa在体内易水解，稳定性较差等缺点，提高抗癌肽Temporin-1CEa在肿瘤细胞内的摄取效率，为今后肽类抗癌新药制剂的研究和临床应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：葡聚糖凝胶(Sephadex G-50)(Biosharp,日本)；MTT(Sigma公司)；DMSO(联邦试剂公司)；96孔细胞培养板(Corning公司)；DSPE-PEG2000(上海艾伟特医药科技有限公司)；胆固醇(沈阳市医药公司化玻站试剂分厂)；乙腈(色谱纯)、氯仿、冰乙醚(天津市科密欧化学试剂)；Temporin-1CEa(上海吉尔生化有限公司)；人乳腺癌细胞MCF-7(凯基生物有限公司)；1640培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国)。

1.1.2 仪器：DF-101S 恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；JY92-2D 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份责任公司)；KQ5200B型高功率数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)；SC-05离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；SPD-M20A 230V CN 高效液相色谱仪(SHIMADZU,日本)；NANO-ZS90激光粒度仪/Zeta电位分析仪；FACSAriaⅡ流式细胞仪；UV-7504PC型紫外可见分光光度仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人乳腺癌MCF-7细胞(凯基生物有限公司)用含10%胎牛血清(Gibco公司，美国)的1640培养液(Gibco公司，美国)。

1.2.2 Temporin-1CEa-LIP制备：分别精密称取S100磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000适量溶于无水乙醚，加入抗癌肽Temporin-1CEa的水溶液，2者相互混合至500 mL茄形瓶中，进行超声波振荡至形成稳定的W/O型乳剂，在冰水浴条件下旋转蒸发除去有机溶剂至形成薄膜。加入pH7.4 PBS溶液水化，在冰浴条件下探头超声(200W 2 min、400W 2 min、600W 2 min)。所形成的脂质体于4 ℃条件下保存备用[15]。

1.2.3 HPLC法测定Temporin-1CEa-LIP包封率：色谱条件：色谱柱为 Diamonsil C15柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为乙腈:水(7:3, v/v);检测波长220 nm;柱温25 ℃;流速1 mL/min;进样量10 μL。以抗癌肽Temporin-1CEa峰面积(A)对其浓度(C, mg/mL) 线性回归得标准曲线。精密量取100 μL载药过柱子脂质体和100 μL载药未过柱脂质体，加入乳化剂破乳，过膜(0.22 μm)，进样测定。根据线性回归方程得出药物浓度，计算包封率EE%(entrapment efficiency, EE%)。包封率=(载药过柱子脂质体中含药物的浓度)/(载药未过柱脂质体中含药物的浓度)×100%。共检测3次。

1.2.4 不同时间Temporin-1CEa-LIP的药物泄露量：精密吸取Temporin-1CEa-LIP 100 μL，分别于0、3、5、9、24和48 h过葡聚糖凝胶柱去除游离药物。加入破乳剂，用HPLC法测定(默认0 h药物含量为100%)。共检测3次。

1.2.5 Temporin-1CEa-LIP粒径和电位考察：取Temporin-1CE-LIP 100 μL，用超纯水稀释至1 mL，采用激光粒度仪/Zeta电位分析仪对其粒径与Zeta电位进行测定。共检测2次。

1.2.6 Temporin-1CEa-LIP体外血清稳定性考察：取Temporin-1CE-LIP与滤过的胎牛血清等体积1:1(v/v)混合，分别于0.5、1、2、4、8和24 h取100 μL，用超纯水稀释至1 mL，采用激光粒度仪/Zeta电位分析仪对其粒度进行测定。共检测3次。

1.2.7 Temporin-1CEa-LIP细胞摄取考察：将人乳腺癌MCF-7细胞以2×105个/mL的密度分瓶，37 ℃、5% CO2过夜培养。根据包封率计算加药浓度，设置实验组和对照组，实验组为FITC标记的Temporin-1CE-LIP，对照组为FITC标记的Temporin-1CE抗菌肽，设每空加药浓度为0、10、30、50 μM，分别作用4、24 h，将原培养液吸出后，用PBS漂洗3次，胰酶消化，离心后用500 μL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞对Temporin-1CE-LIP的摄取强度。共检测3次。

1.2.8 Temporin-1CEa-LIP对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性考察：将人乳腺癌MCF-7细胞，以5×104个/mL接种于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。根据包封率计算加药浓度，设10、20、40、60、80和100 μL浓度梯度。24 h后加入MTT溶液继续培养，4 h后吸掉上清液，加入二甲基亚砜，用酶标仪测定，波长吸光度值492 nm。共检测3次。

2 结果

2.1 Temporin-1CEa-LIP包封率 脂质体的药物包封率是对载药脂质体的一个重要评价。根据线性回归方程：Y=3.8E+6X+7743.6，R2=0.9964，推导药物浓度，计算Temporin-1CEa-Lip的包封率。结果发现，本实验室制备的Temporin-1CEa-LIP包封率为(55.57±1.56)%。

2.2 不同时间Temporin-1CEa-LIP的药物泄露量 脂质体的磷脂双分子层将抗癌肽Temporin-1CEa包封在脂质体内水腔，由于抗癌肽Temporin-1CEa本身的性质，可能会使脂质体膜材料对其包封率产生影响。因此探究Temporin-1CE-LIP不同时间点药物泄漏量，评价其稳定性。由图1可见，Temporin-1CE-LIP在48h后，药物含量仍然在60%左右，说明PEG修饰后的抗癌肽Temporin-1CEa脂质体具有良好的稳定性。

图1 不同时间点Temporin-1CE-LIP药物含量*P<0.05，1h与48h比较Fig.1 The drug content of Temporin-1CE-LIP at different time points( ±s，n=3)*P<0.05，compared 1h with 48 h

2.3 Temporin-1CEa-LIP粒径和zeta电位 为了使Temporin-1 CE-LIP可以有效地递送到肿瘤部位，对其粒径和电位进行测定。由表1和图2可见，Temporin-1CE-LIP的粒径为(105.3±1.37)nm，PDI为(0.215±0.0586)，表明Temporin-1CE-LIP具有良好的均一性。Temporin-1CE-LIP的Zeta电位为(-16.17±0.964)mV，由原来的正值变为负值，且绝对值增大。

表1 Temporin-1CE-LIP的Size 和Zeta电位Tab.1 Size and Zeta potential of Temporin-1CE-LIP ±s，n=2)

图2 Temporin-1CE-LIP粒径Fig.2 Size of Temporin-1CE-LIP

2.4 Temporin-1CEa-LIP体外血清稳定性 为了模拟体内环境，考察Temporin-1CE-LIP进入体内的血清稳定性，本课题将脂质体与胎牛血清混合孵育，并在不同时间点对其粒径进行测定，考察其血清稳定性。由图3可见，Temporin-1CE-LIP在不同的时间点，粒径均在110 nm左右，且保持稳定，说明该脂质体具有良好的血清稳定性。

图3 Temporin-1CE-LIP不同时间点在血清中粒径大小Fig.3 Particle size of Temporin-1CE-LIP at various time points

2.5 Temporin-1CEa-LIP的细胞摄取 为了探究PEG修饰的Temporin-1CE-LIP能否被人乳腺癌MCF-7细胞摄取，本研究进一步考察了4 h和24 h不同时间点的细胞摄取。由图4、5可见，在相同时间条件下，随着孵育浓度的增加，细胞对脂质体的摄取强度显著性增强；在相同浓度条件下，随着孵育时间的增加，细胞对脂质体的摄取强度显著性增强，此结果表明，MCF-7细胞对Temporin-1CE-LIP的摄取呈时间和浓度依赖性。

图4 MCF-7细胞对Temporin-1CE-LIP摄取的流式图Fig.4 The flow cytometry of MCF-7 cell uptake of Temporin-1CE-LIP

图5 MCF-7细胞对Temporin-1CE-LIP摄取量Fig.

2.6 Temporin-1CEa-LIP对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性 为了验证Temporin-1CE-LIP抑癌效果与Temporin-1CEa抗癌肽是否一致，效果是否显著，本研究进行了Temporin-1CE-LIP对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性考察。由图6可见，Temporin-1CEa抗癌肽对人乳腺癌MCF-7细胞IC50值为25.98 μM；Temporin-1CE-LIP对人乳腺癌MCF-7细胞IC50值为29.32 μM，表明Temporin-1CE-LIP作用MCF-7细胞24h与Temporin1-CEa抗癌肽抑癌效果一致。

图6 MTT法检测Temporin1-CEa抗癌肽、Temporin-1CE-LIP对MCF-7 细胞的细胞毒作用Fig.6 Cytotoxic effects of Temporin1-CEa，Temporin-1CE-LIP by

3 讨论

CAPs的抗癌活性显著，对癌细胞不易产生耐药性，能特异性识别癌细胞，且对正常细胞不会造成损害[16]。其中，抗癌肽Temporin-1CEa带有3个正电荷，可以通过静电作用与含负电荷成分的肿瘤细胞的细胞膜结合，杀死癌细胞，达到抑癌效果。本课题组的前期研究表明Temporin-1CEa对人乳腺癌MCF-7细胞具有良好的抑癌效果，在有效杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞无明显毒副作用。然而，包括Temporin-1Cea在内的CAPs具有体内易降解，稳定性差[17]等局限性。

对阳离子抗癌肽进行药学修饰并建立药物载体系统以克服上述缺点并促进其临床转化已经成为目前亟待解决的问题。本研究构建了含抗癌肽Temporin-1CEa的PEG修饰的脂质体载药系统。利用PEG的亲水性，可以减少被网状内皮系统摄取，同时脂质体到达肿瘤部位后，作为“桥梁”直接与细胞膜接触，增加其介导脂质体入胞几率[18-19]。前期研究发现甲醇和氯仿会对Temporin-1CEa抗癌肽理化性质产生影响，且在进行体外细胞实验时甲醇和氯仿的存在会影响实验结果，因此不能选用甲醇和氯仿溶解Temporin-1CEa抗癌肽，而薄膜分散法一般采用氯仿作为溶剂，故排除薄膜分散法制备脂质体，又由于抗癌肽Temporin-1CEa是一种水溶性药物，所以本文采用逆向蒸发法制备Temporin-1CEa-LIP。

近年来，PEG被广泛应用在纳米载体的构建中。其通过渗透和EPR效应到达肿瘤部位发挥作用的被动靶向脂质体的粒径范围是100～200 nm[20]。本实验中制备的Temporin-1CEa-LIP的粒径为105.3 nm，表明通过逆向蒸发法制备的被动靶向脂质体Temporin-1CEa-LIP的粒径满足基本要求。此外，有研究表明，经PEG修饰后的脂质体，粒径和Zeta电位等性质的变化，使其更易进入体内，通过EPR效应作用附集在瘤体周围，发挥抑癌作用[21]。结果显示，Temporin-1CEa-LIP的Zeta电位为-16.17 mV，由原来的正值变为负值，且绝对值增大，说明外层长链 的PEG 可以有效屏蔽内层带正电的阳离子抗癌肽Temporin-1CEa (表 1), 而对正电荷的屏蔽有利于减少脂质体与血浆蛋白的相互作用, 延长其在体内的循环时间，增强了在生物体内的稳定性[22]。但是抗癌肽Temporin-1CEa本身带正电荷，而本实验中的Temporin-1CEa-LIP带有负电荷，这可能会妨碍脂质体与癌细胞的相互作用。然而，本实验制备的阳离子抗癌肽Temporin-1CEa-LIP克服了其体内易降解，稳定性差等局限性，并且PEG可以延长脂质体在体内的循环时间, 改变脂质体的组织分布，使其更好地发挥抑癌作用。

另一方面，体外血清稳定性实验也进一步证明了该载药系统的稳定性。实验结果表明，该脂质体与血清混合后，具有良好的稳定性，这可能是因为PEG修饰后的脂质体可以延长药物载体在体内外的循环时间[23]。此外，体外活性初步评价的实验表明，Temporin-1CE-LIP作用人乳腺癌MCF-7细胞24h与Temporin-1CEa抗癌肽具有相近的抑癌效果，说明脂质体载药系统较好地保留了抗癌肽本身所具有的抑癌活性。

综上所述，PEG修饰的Temporin-1CE-LIP不但提高了抗癌肽Temporin-1CEa在血清中的稳定性还保留了抗癌肽Temporin-1CEa良好的抑癌效果，因此Temporin-1CE-LIP有望成为治疗乳腺癌疾病的一种新型的载药系统。

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(编校：王俨俨)

Construction of cationic anticancer peptide Temporin-1CEa liposomes and evaluation of anti-breast cancer activityinvitro

WU Di1†, ZHAO Ying1†, REN Hui-dan1, SI Xin-hong1, ZHANG Lin1, WANG Che1,2Δ

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2.Liaoning Province Key Laboratory of Biotechnology and Molecular Drug R & D, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo constract and evaluate the cationic anticancer peptide Temporin-1CEa liposomes and evaluate anti-breast cancer activityinvitro.MethodsThe polyethylene glycol (PEG)-modified liposomes containing Temporin-1CEa, one recently discovered cationic anticancer peptide (CAP), were constructed by using reverse-phase evaporation method. The encapsulation efficiency, particle size and Zeta potential of the Temporin-1CEa-containing liposomes (Temporin-1CEa-LIP) were characterized. In addition, that had the furhter evaluated of the stability and specific toxicity against human breast cancer MCF-7 cellsinvitro.ResultsThe data suggested that the PEG-modified liposomes served a promising drug delivery system for CAPs, those indicated by the encapsulation efficiency was (55.57±1.56)%, the particle size was (105.3±1.37) nm and the Zeta potential was (-16.17±0.964) mV. Moreover, theinvitrotest also indicated that Temporin-1CEa-LIP exerted good stability in serum, and it could be efficiently uptaken by MCF-7 cells. Most importantly, after 24h exposure, Temporin-1CEa-LIP showed toxicity against MCF-7 cells, as potent as Temporin-1CEa.ConclusionThe results demonstrates that the PEG-modified liposome is a good drug-delivery system and Temporin-1CEa-LIP could serve as potential anti-tumor candidate for cancer therapy.

anticancer peptide; breast cancer; lipidosome; polyethylene glycol

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.006

国家自然科学基金(81202448)

吴迪，女，本科在读，研究方向：药学，E-mail：1051067749@qq.com；赵颖，共同第一作者，女，硕士在读，研究方向：靶向抗癌肽脂质体的机理研究及应用，E-mail：656684966@qq.com；王澈，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：天然药物抗肿瘤机制研究及应用，E-mail：wangche126@126.com。

R915；TQ464.7；R737.9

A