林佳苗，姜建伟

(1.浙江省台州恩泽医疗中心(集团)台州市中心医院，浙江 台州 318000；2.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022)

Box-Behnken 效应面法优化妇乐颗粒中绿原酸提取工艺

林佳苗1Δ，姜建伟2

(1.浙江省台州恩泽医疗中心(集团)台州市中心医院，浙江 台州 318000；2.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022)

目的 采用Box-Behnken 效应面法,优选妇乐颗粒中绿原酸提取工艺条件。方法 采用HPLC测定妇乐颗粒中绿原酸的含量，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长327 nm；柱温: 30 ℃; 流速: 0.9 mL/min；流动相:乙腈-0.2%磷酸溶液=15:85。以绿原酸提取率为指标，在单因素试验基础上，通过Box-Behnken 试验考察提取时间、料液比、提取次数对提取工艺的影响。结果 最佳提取工艺为加12倍量水提取3次，每次60 min; 绿原酸提取率为3.379%。结论 通过Box-Behnken 效应面法为评价系统优选的提取工艺合理可行，预测性良好,为妇乐颗粒的应用提供参考。

妇乐颗粒；忍冬藤；绿原酸；提取工艺；Box-Behnken 效应面法

妇乐颗粒由忍冬藤、大血藤、甘草、大青叶、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索和熟地黄等10味药材制得，具有化瘀止痛、清热凉血之功效。临床多用于治疗瘀热蕴结所致的带下病，症见带下量多、色黄、少腹疼痛，慢性盆腔炎等症候[1]。君药忍冬藤具有清热解毒，消肿的功效。据文献报道[2-3]：忍冬藤主要活性成分为有机酸类和环烯醚萜苷类，其中绿原酸含量较高，它具有抗病毒、抗菌、保肝利胆、增高白血球、抗菌抗感染、抗肿瘤、降血压及兴奋中枢神经系统等多种药理作用[4-5]。目前，大多研究采用正交设计来优化绿原酸的提取工艺[6-7]，未见Box-Behnken效应面法优化提取工艺方面相关研究。

Box-Behnken(BBD)效应面法是常见的一种效应面优化方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题，是一种连续分析实验点以寻求最优实验条件的方法。BBD效应面法在小区域内用简单一次或二次多项式模型来拟合较复杂的未知函数，找出预测的响应值最优值以及相应的实验条件。本试验采用Box-Behnken效应面法对妇乐颗粒中绿原酸提取工艺影响的关键因素进行优化的同时，旨在验证该试验设计法在中药提取工艺应用中的可行性，也为妇乐颗粒标准化生产提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：妇乐颗粒(湖北襄阳隆中药业集团有限公司生产，规格：6克/袋，6批)；绿原酸对照品(批号110753-201314，供含量测定用)购自中国食品药品鉴定研究院；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。

1.1.2 实验仪器：DIONEX UltiMate 3000 系列高效液相色谱仪(SRD-3400A分析泵、WPS-3000自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、VDW-3000检测器、工作站：Chromeleon©Dionex)；色谱柱： Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；AB-135S型电子天平(METTLER-TOLEDO D=0.01 mg)。

1.2 方法

1.2.1 妇乐颗粒中绿原酸渗漉提取工艺：分别称取照处方比例的忍冬藤、大血藤、甘草、大青叶、蒲公英、牡丹皮、赤芍、川楝子、醋延胡索等九味药材，加水煎煮2次，合并煎液，缩至适量，加水定容至1000 mL，摇匀、过滤。测定滤液中绿原酸的质量浓度，计算绿原酸提取率[提取率=(滤液中绿原酸的质量浓度×滤液体积)/忍冬藤质量×100%]。

1.2.2 色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液=15:85；流速： 0.9 mL/min；进样体积： 10 μL；柱温： 30 ℃；检测波长： 327 nm。

1.2.3 妇乐颗粒中绿原酸的含量测定

① 对照品溶液的制备：取经P2O5真空干燥24 h绿原酸对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，加入甲醇制成每1 mL含46.3 μg的绿原酸对照品溶液，置凉暗处保藏，备用。

② 供试品溶液的制备：精密量取“1.2.1”项下药材浓缩液2.0 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

③ 标准曲线的制备：精密吸取绿原酸对照品溶液2、4、8、16、25、30 μL注入液相色谱仪，记录绿原酸的峰面积。以对照品进样量X(ng) 为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归。

④ 精密度试验精密：吸取绿原酸对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，记录色谱图。

⑤ 稳定性试验：取供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、15、18、24 h按相应色谱条件测定，记录色谱图。

⑥ 加样回收试验：按照妇乐颗粒处方，取已知含量忍冬藤和其它九味药材共6份，按照“1.2.1”和“1.2.3②”方法，分别精密加入绿原酸对照品各适量，依“1.2.2”项下色谱条件测定，测定峰面积，并计算回收率。

1.2.4 妇乐颗粒中绿原酸提取工艺的优化

① 单因素试验:料液比考察：取忍冬藤药材约20 g，其它九味药材取量按照处方比例推算，提取时间为60 min/次，提取2次，分别按料液比1:6，1:8，1:10，1:12，1:14 条件进行提取，依“1.2.2”项下色谱条件测定，计算绿原酸提取率。

提取时间考察：取忍冬藤药材约20 g，其它九味药材取量按照处方比例推算，按料液比1:10，提取2次，考察提取30、40、60、90、100 min 绿原酸的提取率。

提取次数考察：取忍冬藤药材约20 g，其它九味药材取量按照处方比例推算，料液比1:10，提取时间定为60 min，逐步提取1，2，3，4 次，依“1.2.2”项下色谱条件测定，计算绿原酸提取率。

② Box-Behnken 效应面法优化妇乐颗粒提取工艺：提取工艺方案设计：采用软件Design-Expert 8.0.5 中的Box-Behnken 试验设计原理，综合单因素试验结果，以提取次数(A)、料液比(B)、提取时间(C) 为因素，绿原酸提取率(%)为评价指标，设计三因素三水平17个试验点的响应面分析。

模型的建立及显著性检验：以绿原酸提取率为因变量，提取时间、料液比和提取次数为自变量，使用Design Expert 8.0.5 软件对各因素进行二次多元回归拟合，并对模型进行显著性检验。

提取工艺的响应面分析与优化：根据二元多次模型，采用Design-Expert软件分析，作出相应的曲面图和等高线图，并对曲面图和等高线图进行分析，优化提取工艺。

最佳提取工艺确定及验证试验：用Design-Expert 8.0.5 统计软件求解回归方程可以推测出绿原酸最佳提取工艺，并预测出提取率值。

2 结果

2.1 妇乐颗粒中绿原酸的含量测定方法学考察结果

2.1.1 标准曲线结果： 绿原酸回归方程为Y=2.36X-0.05，R2=0.9997。表明绿原酸在0.0923～1.389 μg 范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度试验精密结果： RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性试验结果：绿原酸的峰面积RSD为0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.4 加样回收试验结果：结果绿原酸平均回收率99.4%，RSD=0.5%(n=6)，表明本方法具有较好的加样回收率。见表1。

表1 绿原酸回收率测定结果(n=6)

2.2 妇乐颗粒中绿原酸提取工艺的优化结果

2.2.1 单因素考察结果：

① 料液比考察结果：绿原酸提取率分别为2.11%、2.56%、2.87%、3.32%、3.30%。表明当提高料液比有利于绿原酸的提取，当料液比达到1:12时，绿原酸基本提取完全。

② 提取时间考察结果：绿原酸提取率分别为2.06%、2.89%、3.26%、3.32%、3.30%。表明60 min内绿原酸提取率随提取时间的增而增加，当提取时间大于60 min时，再继续提取，绿原酸提取率没有显著增加，可以推断60 min为最佳提取时长。

③ 提取次数考察结果：结果绿原酸提取率(2次及以后绿原酸累加计算)分别为1.26%、2.72%、3.30%，3.32%，说明忍冬藤提取3～4 次才可以提取完全。

2.2.2 Box-Behnken 效应面法优化妇乐颗粒提取工艺结果

① 提取工艺方案设计结果：优化方案及试验结果见表2。

表2 提取工艺Box-Behnken 试验设计与响应值

② 模型的建立及显著性检验结果：拟合模型如下：绿原酸提取率Y(%)=3.32+0.026A+0.044B+0.087C+0.0025B+0.005AC -0.024A2+0.011B2-0.092C2，A，B，C 为自变量，分别代表提取次数、料液比、提取时间。拟合方程的相关系数R2=0.9522，说明设计模型拟合程度良好，可以用于忍冬藤中绿原酸的提取率的预测。模型的变异系数(CV)为0.90%，在可接受范围。对二次多项模型进行方差分析可知(见表3)，所建立模型有意义 (P<0. 05)，失拟项P=0.405，无统计学意义。C-提取时间一次项、B-料液比一次项、提取时间二次项达到极显著水平(P<0.01)，对绿原酸提取率影响明显。

表3 二元多次回归拟合Box-Behnken 实验设计的方差分析结果

*P<0.05表示显著性差异；**P<0.01表示极显著性差异

③ 提取工艺的响应面分析与优化结果：响应面如图1～3所示。图1可以看出，料液比达到1:12时，绿原酸提取最完全，当提取次数达到大约2.5次时，曲线达到高点，即绿原酸提取率最高，随后有所下降；图2显示的是提取时间和提取次数对绿原酸提取率的影响，由图可以看出，提取时间对提取率的影响呈曲线趋势，先大后小，大概在60 min达到顶峰。

图1 料液比与提取次数对绿原酸提取率的响应面图和等高线图Fig.1 Response surface plot and contour plot of liquid ratio and extraction times

图2 提取时间与提取次数对绿原酸提取率的响应面图和等高线图Fig.2 Response surface plot and contour plot of extraction time and extraction times

图3 提取时间与料液比对绿原酸提取率的响应面图和等高线图Fig.3 Response surface plot and contour plot of extraction time and solid-liquid ratio

④ 最佳提取工艺确定及验证试验结果妇乐颗粒中绿原酸最佳提取工艺为： 提取次数为3，料液比为1:12，提取时间为60 min，此条件下绿原酸与预测值为3.379%。结合实际试验，将料液比定为1 ：12，提取时间定为60 min，提取3 次，进行提取工艺验证试验(n=3)，实际测得绿原酸提取率为3.372%，RSD=0.1%(n=3)，说明该模型可靠。

3 讨论

绿原酸具有抗病毒、抗菌、抗感染等多种功效，具有很好临床应用价值。妇乐颗粒处方中忍冬藤药材含量绿原酸，目前，也有相关文献[8]对忍冬藤中绿原酸开展研究，但是提取方法鲜有报道，本文利用Box-Behnken 效应面法设计并优化忍冬藤药材中绿原酸提取工艺，确立最佳提取工艺参数，为提高妇乐颗粒临床应用范围提高参考。

本研究考察提取次数、提取时间和料液比三因素对绿原酸提取率的影响，利用Box-Behnken效应面法进行实验设计，并按照各试验点条件测出相应提取率，采用二元多次方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过二元多次模型来推测最佳工艺条件。BBD效应面法不仅考察因素与响应值之间作用，还能考察各因素间的相互作用，方法简便合理，试验次数较少，与正交试验和均匀设计相比较，更加直观、合理，精密度和准确度也大大地提高。采用模型推测最佳方法实验所得提取率和预测值接近，进一步验证方法的准确性。

[1] 中华人民共和国药典[M].2015， Vol I(一部)：896.

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(编校：谭玲)

Optimization of processing parameters for extraction of chlorogenic acid in Fule Granula using Box-Behnken experimental design

LIN Jia-miao1Δ, JIANG Jian-wei2

(1. Zhejiang Taizhou Grace (group) Medical Center Taizhou Center Hospital, Taizhou 318000, China；2. Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China)

ObjectiveTo optimize the processing parameters for the extraction of chlorogenic acid in Fule Granula by Box-Behnken experimental design. MethodsThe content of chlorogenic acid in Fule Granula was determination. The separation was performed on a Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18column(4. 6 mm ×250 mm, 5 μm), and column temperature 30 ℃. Aetonitrile-0.2% H3PO4was used as the mobile phase. The detection wavelength was at 327 nm. A three-factor and three-level Box-Behnken experimental design was employed to investigate effects of extraction time, solid-liquid ratio and extraction times on composite score of extracting amount of chlorogenic acid. ResultsOptimum process conditions were as follows:12 times the amount of water extracted three times, each time 60 min; chlorogenic acid extraction rate of 3.379%.ConclusionThis optimized extraction technology has good predictability by Box-Behnken experimental design, and overall desirability, it provides a reference for application of Fule Granula.

Fule Granula; lonicerae japonicae caulis; chlorogenic acid; extraction technology; Box-Behnken experimental design

林佳苗，通信作者，女，本科，主管药师，研究方向：药物制剂工艺，E-mail：3079133348@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.62