魏喜芹，魏世杰，马研妮

(宁夏医科大学总医院 药剂科，宁夏 银川 750004)

一测多评法测定决明子中蒽醌苷元类和萘并吡喃酮苷类有效成分含量

魏喜芹Δ，魏世杰，马研妮

(宁夏医科大学总医院 药剂科，宁夏 银川 750004)

目的 建立决明子中蒽醌苷元类和萘并吡喃酮苷类有效成分含量的一测多评法。方法 采用Sunfire C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，乙腈-0.1% 磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长278 nm和284 nm，测定橙黄决明素与红镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚间的相对校正因子，并考察其重现性，比较计算值与测得值的差异。结果 红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚分别在：0.0503～1.5078、0.3197～9.5899、0.5070～15.2108、0.4027～12.0814 μg范围呈良好线性；回归方程分别为：Y=4.95X+2.01(R2=0.9998)、Y=1.03X+0.03(R2=0.9999)、Y=3.98X-0.12(R2=0.9993)、Y=4.81X+0.26(R2=0.9996)；用一测多评法对6批决明子中大红镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚进行测定，与外标法实测值基本一致。结论 该方法可靠，结果准确，可用于决明子的质量控制。

一测多评法；决明子； 萘并吡喃酮苷； 蒽醌苷元； 红镰霉素龙胆二糖苷；橙黄决明素；大黄酚；大黄素甲醚

决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子。其性味甘、苦、咸，微寒；具有清热明目，润肠通便之功效。常用于目赤涩痛，羞明多泪，头痛眩晕，目暗不明和大便秘结症候[1]。在《神农本草经》中早有记载 “久服能益精光，轻身”，国家卫生部也将决明子药食同源物质之一。据文献报道[2-3]，决明子主要含有蒽醌苷元类、萘并吡喃酮苷类脂肪类、肥皂化物质、糖及氨基酸类和无机元素等成分。其中蒽醌类代表性成分有大黄酚、大黄素甲醚、橙黄决明素、黄决明素、决明素、大黄素等，而萘并吡喃酮苷类的主要代表性成分为红镰霉素龙胆二糖苷、决明子苷、决明子苷B、决明子苷C 等。蒽醌类成分具有泻下和降血脂等作用，萘并吡喃酮苷类可以用于保肝和抗肝毒等症候[4-6]。

目前，针对决明子有效成分相关研究甚多，但大多是围绕单个或者2～3个成分开展，不能达到全面控制决明子质量的目的，而且往往牵涉到许多种对照物质，试验操作繁琐，成本较高[7-8]。因此，本研究选取决明子中蒽醌苷元类代表性成分大黄酚、橙黄决明素、大黄素甲醚和萘并吡喹酮苷类成分红镰霉素龙胆二糖苷为对象，以橙黄决明素为参考物，采用高效液相色谱双波长法建立决明子一测多评法，为控制决明子药品质量和制定质控方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂：决明子药材分别采集于安徽亳州、湖北襄樊、湖北宜春、安徽合肥、陕西西安、安徽阜阳，上述决明子经本市药检所中药室王英华主任鉴定均为豆科决明(CassiaobtusifoliaL)的干燥成熟种子。

大黄素甲醚对照品(批号:110758-201013，99.8%)、大黄酚对照品(批号:110796-201017，99.6%)、橙黄决明素(批号:111900-201504)、以上3种对照物质均购自中国食品药品鉴定研究院；红镰霉素龙胆二糖苷(批号: 20120614)购自上海永恒生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。

1.1.2 实验仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司，1260VWD检测器，Agilent ChemStation for LC systems色谱工作站)；DIONEX UltiMate 3000 系列高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司，SRD-3400A分析泵、WPS-3000自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、VDW-3000检测器、工作站：Chromeleon©Dionex)；Waters 2695-2489高效液相色谱仪(美国沃特世科技有限公司，Empower色谱工作站)；色谱柱：Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sunfire ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)和SHIMADZU C18(250 mm×4.6 mm，4.5 μm)；JL-3600DT型数控超声波清洗器(上海杰理超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Sunfire ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，程序：①0～18 min,乙腈浓度20%→35%，波长278 nm，②18～25 min,乙腈浓度35%→60%，波长284 nm，③25～50 min,乙腈浓度60%→85%，波长284 nm；流速：0.9 mL/min,柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

1.2.2 溶液的制备：

① 混合对照品溶液的制备:精密称取红镰霉素龙胆二糖苷对照品25.1298 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇适量超声使溶解，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为红镰霉素龙胆二糖苷对照品储备液。分别精密称取橙黄决明素、大黄酚、大黄素甲醚对照品各适量至同一50 mL容量瓶中，同时精密量取红镰霉素龙胆二糖苷对照品储备液1 mL置其中，加无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液稀释至刻度，混匀，即制得每1 mL中含有红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚为0.050 259 6、0.319 662、0.507 028、0.402 712 mg的混合对照品溶液，备用。

② 供试品溶液的制备[1]：精密称取6批来源不同的样品粉末(过3号筛)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，加热回流2.5 h，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，加稀盐酸30 mL，置水浴加热水解1 h，置冰浴冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液使溶解，转移至25 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

1.2.3 系统适应性实验：取混合对照溶液和供试品溶液按“1.2.1”项色谱条件进行分析，记录色谱图。

1.2.4 一测多评方法学考察

① 线性关系的考察：按照“1.2.1”项色谱条件，精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20、25、30 μL，注入色谱仪测定，记录谱图。以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，以对照品峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归。

② 稳定性试验：取安徽亳州产决明子供试品溶液，室温放置0、5、10、15、18、24、30、36 h，按照“1.2.1”项的色谱条件进行测定。

③ 精密度试验：取混合对照品溶液10 μL，按照“1.2.1”项的色谱条件，连续进样6针，记录色谱图。

④ 加样回收率试验：取已知含量的安徽亳州产决明子粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚对照品混合液1 mL(分别相当于0.050 3、0.319 7、0.507 0、0.402 7 mg)，按“1.2.2”项下供试品制备方法和“1.2.1”项色谱条件测定，计算回收率。

1.2.5 相对校正因子计算：本研究以橙黄决明素为内参物，分别计算红镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚的相对校正因子。按王智民等[9]提出的一测多评公式计算：

f=fs/fi=AsCi/AiCs

(注：As——内参物对照品峰面积，Cs——内参物浓度，Ai——待测成分峰面积，Ci——待测成分浓度)。

精密吸取5、10、12、15、20、25 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.6 校正因子重现性考察：精密吸取对照混合溶液，分别在3台不同型号高效液相色谱仪(Waters 2695-2489、SHIMADZU LC-10tvp、戴安UltiMate 3000)上进行试验，每台仪器分别考察Sunfire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和SHIMADZU C18(250 mm×4.6 mm，4.5 μm)3根不同厂家色谱柱对相对校正因子的影响。

1.2.7 色谱峰专属性考察：一测多评法应用的前提必须是色谱峰能够准确定位，本实验结合各成分色谱图整体特征采用相对保留时间进行定位，并采用不同型号高效液相色谱仪对相对保留时间进行考察。

1.2.8 样品测定：取6批来源不同的决明子粉末，按照“1.2.1”项的色谱条件进行试验，分别采用外标法和一测多评法计算红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚含量。

2 结果

2.1 系统适应性试验结果 各组分峰分离良好，分离度均大于1.5，理论塔板数按橙黄决明素计大于3000，各峰峰形较好，本色谱系统适合本研究成分的分析。见图1。

图1 对照品(A)和样品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard (A) and sample(B)

2.2 一测多评方法学考察结果

2.2.1 线性关系考察结果：红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚线性回归方程分别为：Y=4.95X+2.01(R2=0.9998)、Y=1.03X+0.03(R2=0.9999)、Y=3.98X-0.12(R2=0.9993)、Y=4.81X+0.26(R2=0.9996)，线性范围分别在：0.0503～1.5078、0.3197～9.5899、0.5070～15.2108、0.4027～12.0814 μg。

2.2.2 稳定性试验结果：红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积RSD(n=8)分别为1.4%、0.6%、0.9和1.2%，表明供试品溶液在36 h稳定。

2.2.3 精密度试验结果：结果红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚的峰面积RSD(n=6)RSD分别为0.5%、0.2%、0.8%和0.9%，表明仪器的精密度良好。

2.2.4 加样回收率试验结果：各成分回收率结果见表2～5。

表2 红镰霉素龙胆二糖苷回收率测定结果(n=6)

表3 橙黄决明素回收率测定结果(n=6)

表4 大黄酚回收率测定结果(n=6)

表5 大黄素甲醚素回收率测定结果(n=6)

2.2.5 相对校正因子计算结果：镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚的相对校正因子分别为0.680、1.125和0.972，RSD(n=6)分别为1.1%、0.3%和0.5%。

2.2.6 相对校正因子重现性考察结果：通过对三台色谱仪和三根色谱柱交叉考察，结果镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚的相对校正因子RSD分别为1.0%、0.2%和0.5%，相对校正因子重现性较好，方法耐用性强，简单实用。见表6。

表6 高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子的影响(n=9)

2.2.7 色谱峰专属性考察结果：依“1.2.1”色谱条件测定，结果红镰霉素龙胆二糖苷、橙黄决明素、大黄酚和大黄素甲醚相对保留时间分别为：0.742、1.757和2.004，RSD(n=9)分别为0.5%、0.3%和0.6%。相对保留时间比较稳定，可用来准确定位各种成分，为进一步开展一测多评法研究打下基础。

2.2.8 样品测定结果：为分析一测多评法与外标法是否存在差异，笔者采用2种方法进行考察：①通过比较两种方法所测含量的夹角余弦值[5]，红镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚夹角余弦值分别为0.999 2、0.999 2和0.999 3；②2种方法测定结果RSD值均小于0.5%。可以看出采用一测多评法和外标法测得结果基本一致。见表7。

表7 样品的测定结果

3 讨论

本研究旨在建立一种简便快捷实验方法来控制决明子药材中有效成分的含量。实验初期，曾计划尽可能多的将该药材所含成分纳入研究，后经试验发现有个别成分在不同来源的药材中含量差异太大，有的甚至检测不出。所以最终确定本研究4中目标成分为研究对象，而这4中成分中，橙黄决明素在不同来源决明子中含量差异不大，而且含量较高，峰行也可以，确定将此作为参考物以研究其他成分。

药材提取是否完全对试验结果影响很大，本实验涉及到两类化合物，本身物理性质存在差异，这给供试品制备方法的建立带来很大麻烦。为探索供试品制备方法，在前期预实验-正交实验的基础上，确定甲醇浓度、溶剂用量、加热回流时间为主要影响因素，本研究提取条件可以将目标成分完全提取。

通过对混合对照溶液紫外可见光全波长扫描，光谱图在225、258、275、278、284 nm处有较好的吸收，结合相关文献，试验初期采用278 nm为检测波长进行试验,发现橙黄决明素、大黄酚、大黄素甲醚有较好色谱行为，但红镰霉素龙胆二糖苷信号较弱，无法满足定量计算要求，最后采用278 nm和284 nm波长变换方法进行试验，结果能达到较为理想的效果。

一测多评法(QAMS)有着简便、快捷、经济等优点，不少文献采用一测多评法对中成药进行了研究[9-12]，它可以解决因对照品不足或不稳定所带来药品无法检测的困难，同时也可以避免配制多种对照品给实验带来的误差，是一种值得探讨检验方法。本研究可以在确证橙黄决明素的前提下，利用相对保留时间对红镰霉素龙胆二糖苷、大黄酚和大黄素甲醚进行定性，利用相对校正因子对3种成分进行定量，为对决明子进行全面质控参考。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M]. 2015年版.北京：化学工业出版社，2015：896-897.

[2] 张啟伟，阴健，张俊.生、炒决明子及其煎剂中部分活性成分的比较[J].中草药，1996，27(22)：79-81.

[3] 王晶彬，周旭，胡志方，等.基于指标成分和HPLC 指纹图谱检测的决明子化学品质评价研究[J].中草药，2008，39(6)：917-919.

[4] 唐力英，王祝举，邬秋萍.HPLC 测定决明子中红镰霉素龙胆二糖苷的含量[J].中国中药杂志，2008，3(4)：366-368.

[5] Wang SM.New antihepatotoxic naphthapyrone glycosides from the seeds of Cassia tora[J].Plant Med.1989,55(3):276-278.

[6] Choudhary M,Gulia Y.Cassiatora: its chemistry,medicinal uses and pharmacology[J]. Pharmacologyonline,2011(3): 78.

[7] 杜睿，翁朝泽，高璐璐，等. 决明子的HPLC指纹图谱及3种游离蒽醌含量的同步测定[J].药物生物技术，2014，21(5) ：445-448.

[8] 徐义龙，唐力英，周喜丹，等. HPLC测定决明子中3种萘骈吡喃酮苷含量[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(5):54-56.

[9] 王智民，高慧敏，付雪涛，等.一测多评法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志，2006，31(23)：1925-1928.

[10] 高慧敏，宋宗华，王智民，等.适合中药特点的质量评价模式—QAMS 研究概述[J].中国中药杂志，2012，37(4)：405-416.

[11] 陈建维，刘圆，刘晟楠，等.一测多评法测定枳实中4 种黄酮类成分[J].中草药，2015，46(9)：1374-1377.

[12] 刘圆，魏惠珍，龚建平，等.一测多评法测定健脾丸中4 种黄酮类成分[J].中成药，2015，37(5)：995-999.

(编校：王冬梅)

Determination of naphthopyrone glycosides and anthraquinone aglycone inCassiatoraLby quantitative analysis of multi-components by single marker

WEI Xi-qinΔ, WEI Shi-jie, MA Yan-ni

(Department of Pharmacy, Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750004, China)

ObjectiveTo develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS) for determination of effective components of naphthopyrone glycosides and anthraquinone aglycone inCassiatoraL.MethodsThe separation was performed on a Sunfire C18column(4. 6 mm ×250 mm，5 μm), and column temperature 30 ℃. Aetonitrile-0.1% H3PO4was used as the mobile phase with gradient elution. The detection wavelength was at 278 nm and 284 nm. Relative correction factor by determination of Between aurantio-obtusin and rubrofusarin-gentiobioside or chrysophanol or physcion.the method was evaluated for reproducibility, and the difference between calculated and measured values was compared. ResultsRubrofusarin-gentiobioside, aurantio-obtusin, chrysophanol and physcion respectively 0.0503-1.5078,0.3197-9.5899,0.5070-15.2108, 0.4027-12.0814 μg showed a good linear relationship, and the regression equation isY=4.95X+2.01(R2=0.9998),Y=1.03X+0.03(R2=0.9999),Y=3.98X-0.12(R2=0.9993),Y=4.81X+0.26(R2=0.9996).The quantitative results of six batches ofCassiatoraLby QAMS was basically consistent with that by external standard method. ConclusionThe QAMS method was reliable and accurate, which might be used for the quality control ofCassiatoraL.

quantitative qnalysis of multi-components by single marker;CassiatoraL;naphthopyrone;anthraquinone;rubrofusarin-gentiobioside;aurantio-obtusin;chrysophanol;physcion

魏喜芹，通信作者，女，本科，副主任药师，研究方向：药物的临床应用，E-mail：3362869693@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.60