王真真，戴新建，郑纪阳，王万铁

(1.温州市中心医院 呼吸科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学病理生理学系缺血/再灌注研究室，浙江 温州 325035)

CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白在小鼠肺缺血再灌注损伤中的作用机制

王真真1Δ，戴新建1，郑纪阳1，王万铁2

(1.温州市中心医院 呼吸科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学病理生理学系缺血/再灌注研究室，浙江 温州 325035)

目的 本研究旨在探讨CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)在小鼠缺血再灌注损伤时的作用，并分析其可能机制。 方法 50只C57BL/6J小鼠随机分为5组，每组10只：假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、PBS+LipofectamineTM2000转染试剂组(I/R+PBS+Lipo组)、阴性对照组(I/R+siRNASCR组)、I/R+siRNACHOP组。各组检测总肺水含量(TLW)、肺湿干重比(W/D)和肺泡细胞损伤定量指标(IQA)，分别用半定量RT-PCR和Western blot检测CHOPmRNA及CHOP蛋白的表达。结果 与Sham组相比，I/R组、I/R+PBS+Lipo组和I/R+siRNASCR组W/D、TLW及IQA值升高 (P<0.05)；经CHOP-siRNA干预后，I/R+siRNACHOP组W/D、TLW及IQA值下降(P<0.01)；与Sham组相比，I/R组、I/R+PBS+Lipo组和I/R+siRNASCR组CHOPmRNA及CHOP蛋白水平均表达增加(P<0.01)，经CHOP-siRNA干预后，I/R+siRNACHOP组CHOPmRNA及CHOP蛋白水平均下降(P<0.01)。结论 I/R引起小鼠肺组织细胞发生过度的未折叠蛋白反应，并通过CHOP信号转导通路最终导致细胞凋亡，损伤肺组织；抑制CHOP凋亡途径可减轻肺缺血再灌注损伤。

肺；再灌注损伤；CHOP；凋亡

缺血再灌注损伤是指组织缺血后，突然恢复血液供应导致的组织损伤。在多种肺脏疾病中，肺缺血再灌注损伤(pulmonary ischemia reperfusion injury，PIRI)产生至关重要的作用，尤其肺移植术作为许多晚期肺部疾病的治疗手段，在临床上仍具有较大的局限性，因此深入探讨PIRI的发生机制，尽可能在术后保护肺组织，改善疾病预后显得十分迫切而且重要。研究表明，细胞凋亡在肺缺血/再灌注损伤的发生机制中起关键作用[1]。研究证明[2]，I/R通过多种途径引起细胞凋亡，导致组织损伤，其中，CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)是重要的促凋亡信号分子，在内质网应激中起重要作用。本研究旨在探讨CCATT/增强子结合蛋白同源蛋白途径在肺缺血再灌注细胞凋亡中的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康SPF级C57BL/6雄性小鼠50只，体质量(20±2 g)，6～8周，动物使用许可证号：SYXK(浙2010-0150)，由温州医科大学实验动物中心提供。本实验过程均遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 实验仪器：小动物呼吸机(型号：HX-100E，中国成都泰盟科技有限公司)，紫外分光光度计(型号：UV2450，日本岛津公司)，蛋白电泳仪系统(美国 BIO-RAD 公司)，AL204 电子秤(美国METTLER TOLEDO公司)，梯度PCR仪(日本 Bioer公司)，BA-200光学显微镜(日本 Motic公司)。

1.1.3 主要试剂：原位细胞凋亡检测试剂盒(LOT:13022000,德国Roche公司)， siRNASCR试剂(编号：SS110422004，invitrogen,US)，LipofectamineRTM2000试剂(invitrogen,US)，Trizol试剂(ambion/RNA,Life technologies,US)，PCR试剂盒(Fermentas Life Science,US)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天生物技术研究所)， 脱氧核糖核酸酶(Sigma，US)， DMEM/ F12培养基( Gibico公司)，预染蛋白Maker(Fermentas Life Science,US)，丽春红染色液(中国碧云天生物技术研究所)，其余均为市售分析纯。

siRNACHOP的设计合成：从Genbank 数据库检索CHOP基因序列为：GADD153 genelID:13198。使用Ambion公司的siRNA设计软件设计siRNACHOP序列。

1.2 方法

1.2.1 动物模型复制和分组:参考文献[3]的方法制作小鼠模型。设置小动物呼吸机参数，潮气量0.6 mL，吸呼比3:2，呼吸频率120次/min。小鼠腹腔内注射氯胺酮(0.1 mg/g)+塞拉嗪(0.01 mg/g)，成功麻醉小鼠后，气管插管接呼吸机，打开左侧胸腔，暴露左肺门，用动脉夹夹闭30 min，造成缺血期，然后松开，为再灌注期。松开3 h后，取左肺组织。本实验采用夹闭肺门的方法建立模型，使实验肺完全处于缺血并且不通气的状态，在I/R 组中1只小鼠因开胸损伤动脉，出血死亡，其余顺利造模，成功率98%。

随机将实验小鼠分5组，每组10只： Sham组：假手术组，暴露左肺后，不夹闭肺门，3.5 h后取出左肺；I/R组：缺血再灌注组，夹闭肺门30 min，松开动脉夹3 h，取出肺组织；I/R+PBS+Lipo组：给予小鼠LipofectamineTM2000转染试剂和PBS溶液，其余处理同缺血再灌注组；I/R+siRNACHOP组：予LipofectamineTM2000转染试剂及其包裹的siRNACHOP和PBS溶液，其余处理同缺血再灌注组。I/R+siRNASCR组：给予LipofectamineTM2000转染试剂和其包裹的无关序列的siRNA(能进入RNAi途径，但无干扰作用)和PBS溶液，其余处理同缺血再灌注组；实验前2 d通过一次性鼻饲法干扰小鼠基因。其中siRNA 试剂配置：250 μL PBS液加至150 μg siRNA混匀稀释，200 μL PBS加至50 μL LipofectamineTM2000转染试剂混匀稀释，然后将250 μL 转染试剂稀释液加至250 μL siRNA中混匀，孵育15 min，稳定后可使用。每只小鼠鼻饲总量50 μL，siRNA给予量15 μg。

1.2.2 肺水含量(total lung water，TLW)和肺湿干重比(Wet/Dry，W/D)：湿重(W)：取左肺上叶组织经过漂洗，吸干表面水分后的重量；干重(D)：70 ℃下24 h烘干后的重量，2者之比为肺湿干重比(W/D)。TLW=(W-D)/D。

1.2.3 肺泡损伤数定量评价指标(index of quantitative assessment of histologic lung injury，IQA)检测:各组获取左肺下叶组织，大小0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，予切片，在BA-200光学显微镜下观察每组小鼠肺组织标本，随机连续观察50个视野，计数损伤肺泡数与总肺泡数，其中损伤肺泡数所占的比值就是肺泡损伤数定量评价指标 (IQA)。

1.2.4 半定量逆转录-聚合酶链反应分别检测CHOP水平：取得保存的左肺组织中，取其90～100 mg，加入Trizol 1 mL混匀离心，继而将200 μL氯仿加入取得的上清液中，震荡30 s，室温静置10 min，高速离心15 min，倒入1.5 mL RNase-free离心管，加入异丙醇，在-20 ℃温度下静置30 min，高速离心15 min， 倒去上清液后，加入1 mL用DEPC-H2O稀释的75%酒精，充分混匀，静置沉淀后，高速离心5 min，移去上清液，真空离心干燥5～10 min，溶于10 μL DEPC-H2O中； 将99 μl DEPC-H2O加入上述提取的RNA 1 μL，测定RNA浓度；将RNase Free dH2O 10 μL，Oligo dT Primer 1 μL和RNA溶液1 μL在Microtube管中配制成混合液，加入反应试剂，逆转录合成cDNA ；PCR扩增反应体系进行cDNA扩增，PCR反应条件为：变性温度和时间为94 ℃，1 min；退火温度和时间为 59.1 ℃，30 s；延伸反应温度72 ℃，时间10 min，循环次数33次。计算CHOP mRNA的相对含量。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测肺组织中CHOP蛋白含量：取左肺组织100 mg，充分裂解肺组织，BCA蛋白浓度测定试剂中的试剂A和试剂B按50:1的比例，均匀混合，配制成适量工作液，BSA标准品浓度稀释成0.5 mg/mL，稀释后的标准品分别以0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到各EP管中，用PBS液定容至20 μL，每管取出2 μL，再用PBS补到20 μL，将工作液200 μL分别加至各管，混合后使用紫外可见分光光度仪测定A562nm，根据标准曲线计算CHOP蛋白浓度。

1.2.6 Western blot检测肺组织中CHOP蛋白含量：将5 μL 四甲基乙二胺、10%过硫酸铵100 μL和10 ml 10%分离胶混匀后，灌胶，倒入异丙醇。将50 μL 10%过硫酸铵 、四甲基乙二胺5 μL 和配制好的5%浓缩胶5 mL混匀，立即灌胶至顶部，将聚四氟乙烯齿梳垂直插入，胶完全聚合后拔出梳子，并把凝胶置入电泳槽。将电泳缓冲液倒入电泳槽。制备上样液，用100 ℃沸水煮沸，5 min后冷却，随后进行离心1 min，加入电泳槽上样孔，约20 min 80 V恒压电泳后，当溴酚蓝指示剂进入后将电压改为100 V，溴酚蓝迁移至离凝胶最下缘约0.5 cm处时结束电泳。经过转膜，洗膜和孵育后，将膜置入化学发光检测试剂中反应，在暗室中进行感光、显影、定影。使用Quantity One凝胶软件分析系统进行分析，以目的蛋白CHOP条带吸光度和GAPDH吸光度比值代表CHOP含量。

2 结果

2.1 各组肺组织总肺含水量(TLW)、湿干重比(W/D)及肺泡损伤评估(IQA)的变化 5组间W/D、TLW及IQA比较差异有统计学意义(F=28.27，P=0.00；F=26.87，P=0.00；F=169.4，P=0.00)。与其他组相比，Sham组 TLW、W/D及IQA值最低，差异有统计学意义(P<0.05)。经CHOP-siRNA干预后，I/R+siRNACHOP组TLW、W/D及IQA值均下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组肺组织W/D、TLW及IQA的比较

*P<0.05，**P<0.01，与Sham组比较，compared with Sham group；△P<0.05，△△P<0.01，与I/R组比较，compared with I/R group

2.2 各组CHOP基因表达水平的变化 5组间CHOP mRNA比较差异有统计学意义(F=163.8，P=0.00)。与其他组比较，Sham组CHOP mRNA表达最低，在I/R组、I/R+PBS+Lipo组和I/R+ siRNASCR组中均表达显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。经CHOP-siRNA干预后，CHOP mRNA在I/R+siRNACHOP组中表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、图1。

图1 RT-PCR法检测各组肺组织CHOPmRNA表达水平变化A：Sham组；B：I/R组；C：I/R+PBS+Lipo组；D：I/R+siRNASCR组；E：I/R+siRNACHOP组*P<0.05，**P<0.01，与Sham组比较；△△P<0.01，与I/R组比较Fig.1 Expression of CHOPmRNA in lung tissue in each group by RT-PCRA: Sham group; B：I/R group；C：I/R+PBS+Lipo group；D：I/R+siRNASCR group；E：I/R+siRNACHOP group*P<0.05，**P<0.01， compared with Sham group；△△P<0.01， compared with I/R group

组别只数CHOPmRNASham100.395±0.026I/R100.811±0.031**I/R+PBS+Lipo100.817±0.022**I/R+siRNASCR100.855±0.060**I/R+siRNA-CHOP100.497±0.090*△△

*P<0.05，**P<0.01，与Sham组比较，compared with Sham group；△△P<0.01，与I/R组比较，compared with I/R group

2.3 各组CHOP 蛋白表达水平的变化 5组间CHOP蛋白表达水平差异有统计学意义(F=1071，P=0.00)。与其他组比较，Sham组CHOP蛋白表达最低，在I/R组、II/R+PBS+Lipo组和I/R+siRNASCR组中表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。经CHOP-siRNA干预后，CHOP蛋白在I/R+siRNACHOP组中表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3、图2。

表3 各组CHOP蛋白含量变化比较

*P<0.05，**P<0.01，与Sham组比较，compared with Sham group；△△P<0.01，与I/R组比较，compared with I/R group

图2 Western blot法检测各组肺组织CHOP蛋白含量A：Sham组；B：I/R组；C：I/R+PBS+Lipo组；D：I/R+siRNASCR组；E：I/R+siRNACHOP组*P<0.05，**P<0.01，与Sham组比较；△△P<0.01，与I/R组比较Fig.2 Expression of CHOP protein in lung tissue in each group by Western blotA: Sham group; B：I/R group；C：I/R+PBS+Lipo group；D：I/R+siRNASCR group；E：I/R+siRNACHOP group*P<0.05，**P<0.01， compared with Sham group；△△P<0.01， compared with I/R group

3 讨论

上世纪开始，许多学者对肺缺血再灌注损伤进行了大量的临床探索和实验研究，认为它与大量氧自由基的生成及其引发的脂质过氧化反应、细胞凋亡、肺泡-毛细血管屏障渗透性增高、炎性介质的释放、细胞内钙超载、中性粒细胞渗出等多种因素有关[4]。随着对PIRI逐步深入地了解，其损伤过程中的细胞转导机制引起学者们的关注。近年发现，在肺缺血再灌注损伤中，细胞凋亡起重要作用[5]。

目前，小鼠在体单侧肺原位缺血再灌注损伤模式夹闭肺门，断开了支气管血供，使实验肺处于无通气并且完全缺血的状态，该模型在实验中使用广泛。为进一步探讨肺I/R损伤相关机制打好基础，并且通过W/D、光镜、电镜和RT-PCR等技术证实了模型的稳定可靠性。

细胞凋亡能维持组织结构稳定，并在细胞增殖和死亡中起到关键的作用，研究表明，PIRI造成了肺组织中许多细胞的凋亡[6]。有学者在临床实验中发现在急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)早期患者的肺组织中，细胞凋亡明显增加[7]。也有学者发现烫伤后大鼠肺组织存在着细胞凋亡[8]。

内质网(endoplasmic reticulum，ER)应激由于导致未折叠蛋白的增多和蛋白质合成错误[9]，而产生未折叠蛋白反应(unfolded protein，UPR)。在ERS初期，UPR对机体发挥保护作用，一方面增加ER容量，提高ER对蛋白折叠的能力，另一方面分解减少细胞内错误折叠蛋白，并减少进入内质网的新合成蛋白数量[10]，减少未折叠蛋白在内质网的堆积，重建细胞内稳定状态。而当非折叠以及错误折叠蛋白数量过多，稳态重建失败时，内质网应激持续增强，从而触发了细胞凋亡。

CHOP属于 C/EBP转录因子家族，是ERS诱导凋亡下游信号传导道路的一个关键特异性转录因子，CHOP是ERS的经典标志物[11]。正常情况下，细胞内CHOP表达很低，当ERS时，其表达明显增加[12]。CHOP在哺乳动物组织细胞中广泛存在，与多种细胞的增殖、分化、凋亡等功能相关[13]。ATF6、PERK及IRE1三条途径都能够诱导CHOP的转录。此外，PERK通路激活，诱导转录因子ATF4表达，并与启动子氨基酸反应元件位点结合， CHOP被激活[14]。在内质网应激初期，蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)减少新合成蛋白的数量，维持细胞稳态，随着稳态重建失败，PERK信号持续增强，CHOP的表达增多，引起细胞死亡[15]。

本实验依据RNAi原理[16]，体外化学合成siRNA并加以修饰，采用阳离子脂质体载体LipofectamineTM2000转染试剂包裹CHOP-siRNA，通过鼻饲法干扰实验小鼠，沉默CHOP基因。RNA干扰是序列特异的转录后基因沉默机制，是阻抑基因表达的一种新方法，是将一段与目的基因同源的dsRNA序列，人工导入后引起其mRNA表达缺失，实现基因沉默。

本研究显示，CHOP在Sham组中低表达，在I/R组中表达明显，说明肺I/R成功诱导了内质网应激。在I/R组、I/R+PBS+Lipo组和I/R+siRNASCR组中CHOPmRNA和CHOP蛋白表达显著增加(P<0.01)，经CHOP-siRNA干预后，CHOP mRNA及CHOP蛋白在I/R+siRNACHOP组中表达量均下降(P<0.01)，表明I/R引发了小鼠肺组织细胞过度的未折叠蛋白反应，引起内质网应激持续增强，并通过CHOP信号转导通路，最终引起细胞凋亡以及肺组织损伤；抑制CHOP凋亡途径将会明显减轻PIRI。

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(编校：王俨俨)

Role of CHOP pathway in ischemia-reperfusion induced lung injury in mice and its molecular mechanism

WANG Zhen-zhen1Δ, DAI Xin-jian1, ZHENG Ji-yang1, WANG Wan-tie2

(1.Department of Pneumology, Wenzhou Central Hospital, Wenzhou 325000, China;2.Department of Pathophysiology， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China)

ObjectiveTo evaluate the role of CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP) in ischemia-reperfusion induced lung injury, and clarify the potential molecular mechanism. MethodsFifty mice of C57BL/6J were randomly divided into five groups, 10 mice in each group, including Sham operation group(sham group)，ischemia/reperfusion group (I/R group), I/R+PBS+Lipofectamine group(I/R+PBS+Lipo group), I/R+scramble siRNA group(I/R+siRNASCR group), I/R+CHOPsiRNA group(I/R+siRNACHOP group). The content of total lung water (TLW), wet-to-dry weight ratio (W/D) of lung and index of quantitative assessment of histologic lung injury (IQA) were detected, CHOP mRNA and protein expression were detected by RT-PCR and Western blot. ResultsCompared with Sham group, W/D, TLW and IQA were significantly elevated in I/R group,I/R+PBS+Lipo group and I/R+siRNASCR group (P<0.05). Moreover, the W/D,TLW and IQA reduced with CHOP-siRNA treatment, respectively(P<0.01). Compared with Sham group, CHOP mRNA and protein expressions were significantly elevated in I/R group,I/R+PBS+Lipo group and I/R+siRNASCR group, Moreover, the CHOP mRNA and protein expressions reduced with CHOP-siRNA treatment, respectively(P<0.01). ConclusionI/R could cause excessive unfolded protein response in lung tissue, and induce apoptosis by CHOP signal pathway, damage lung tissue. The inhibition of CHOP pathway could alleviate lung ischemia-reperfusion injury.

lung； reperfusion injury； CHOP； apoptosis

温州市科技局课题(Y20140060)

王真真，通信作者，女，硕士，研究方向：呼吸科临床医学，E-mail：wangzhz@yeah.net。

R363.2

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.11