高瑛，刘亚军，蔡欣然，刘培庆，李民

(中山大学 药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州 广东 510006)

羰基氰氯苯腙调节非经典自噬的机制研究

高瑛，刘亚军，蔡欣然，刘培庆Δ，李民Δ

(中山大学 药学院/新药成药性评估与评价国家与地方联合工程实验室，广州 广东 510006)

目的 探讨可以调控羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)诱导的不依赖自噬关键基因的非经典自噬的影响因素。方法 分别将野生型细胞和自噬关键基因敲除/敲低的细胞(Atg5-KO MEF，FIP-200 KO MEF，ULK1-KO MEF，Beclin 1-KO U251)用CCCP 处理，观察GFP-LC3的分布聚集情况和LC3蛋白水平的表达。荧光定量PCR检测CCCP处理后LC3B mRNA水平变化。Western blot检测FIP200-KO MEF中CCCP 处理时，水通道蛋白抑制剂对LC3 蛋白水平的影响。结果 在Atg5-KO MEF细胞中，和对照组相比，CCCP 处理组免疫荧光实验不能产生GFP-LC3 自噬斑点，Western blot结果显示LC3-I 型不能转变为LC3-II。而在ULK1-KO MEF，FIP200-KO MEF，及Beclin1-KD U251细胞中，CCCP 处理组免疫荧光实验能产生GFP-LC3自噬斑点，同时LC3-I 型也能转变为LC3-II型。但CCCP 处理不影响LC3B的mRNA水平。CCCP 诱导的非经典自噬能被水通道蛋白抑制剂所抑制。结论 CCCP 诱导的非经典自噬需要自噬关键基因Atg5 参与，但不需要Beclin 1，ULK1，FIP200的参与，不影响LC3B 的转录调控。渗透压不平衡可以调节CCCP诱导的自噬。

自噬；渗透压不平衡；羰基氰氯苯腙；LC3； MEF

自噬(巨自噬)是对细胞内衰老细胞器、长寿命蛋白以及外源病原微生物进行吞噬然后与溶酶体融合并降解内含物的过程，其在进化过程中具有高度保守性[1]。已有大量研究报道自噬与肿瘤、神经退行性疾病、感染免疫等多种疾病密切相关[1-3]。近年来发现自噬体的形成可以不经过某些经典自噬的步骤，抑或是不依赖于某几个经典自噬相关蛋白，被称为非经典自噬[4]。这些经典自噬的替代通路增加了自噬分子机制研究的复杂性，同时也为与经典自噬缺陷相关的疾病治疗提供了新的可能。

羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)是一个脂溶性的弱酸以及强线粒体解偶联剂，可提高线粒体内膜的质子渗透性[5]。CCCP 目前作为线粒体自噬研究的常用工具化合物，可以改变线粒体膜电位和使线粒体去极化，并被认为可诱导自噬以清除被去极化的线粒体[6]。本课题组之前研究发现CCCP可以诱导非经典自噬[7]。本文旨在对CCCP诱导的非经典自噬机制进行深入探究，为与经典自噬缺失的相关疾病提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：WT MEF细胞、FIP200-KO MEF细胞、Atg5-KO MEF细胞、ULK1-KO MEF细胞、Beclin1-KD U251细胞均由本实验室保存，稳定转染GFP-LC3质粒的各种细胞由本实验室保存[8]。

1.1.2 主要试剂：CCCP(215911)购自德国Merck 公司。AgNO3(204390)和Phloretin(P7912)购自美国Sigma-Aldrich 公司。GAPDH(sc-365062)购自美国Santacruz公司。LC3(L7543)、tubulin(T6074)购自美国Sigma-Aldrich公司。Cocktail protease和HRP-偶联二抗购自美国Thermo Scientific。Trizol购自美国Invitrogen。RT-PCR试剂盒购自中国大连宝生物公司。

1.1.3 仪器：荧光显微镜EVOS FL Auto(Life Technologies，美国)；双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)；CO2培养箱(Thermo，美国)；酶标仪(BioTek，美国)；ImageQuant LAS 4000mini(GE，美国)；蛋白电泳、电转系统(Bio-Rad，美国)。IQ5荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将稳定转染GFP-LC3 的WT、Atg5-KO、ULK1-KO、和FIP200-KO的MEF细胞以及Beclin1-KD的U251细胞，培养于含有10%胎牛血清(Invitrogen，10099-141)的DMEM(Thermo Scientific，SH3024301) 培养液中，于37 ℃，5% CO2的孵箱中培养。

1.2.2 Western blot 法检测蛋白表达：提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测细胞蛋白含量，上样量为30 μg，将蛋白变性，采用12% SDS 分离胶和5%浓缩胶进行电泳，电泳结束后转移至PVDF 膜(Bio-Rad)，室温封闭1 h后孵一抗(1:1000)4 ℃过夜。漂洗后加入二抗(1:5000)，室温孵育1 h，化学发光试剂增强反应，ImageQuant LAS 4000mini 显影成像。

1.2.3 细胞图像分析：将培养在96孔板稳定转染GFP-LC3的细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗2遍，再加入PBS缓冲液，EVOS FL Auto(Life Technologies)荧光显微镜拍照。每孔至少选择3个视野50个细胞计算荧光斑点的个数。每个实验重复3遍。

1.2.4 荧光定量PCR：Trizol 提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定RNA 浓度和纯度。参照RT-PCR 试剂盒说明书进行逆转录反应。按照SYBR Green说明书反应体系加入荧光染料、引物和RT产物后在Bio-Rad IQ5 PCR仪中进行real-time PCR反应。 LC3B上游引物：5’-CCC ACC AAG ATC CCA GTG AT-3’，LC3B下游引物：5’-CCA GGA ACT TGG TCT TGT CCA-3’， β-actin上游引物：5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’，β-actin下游引物：5’-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3’。所有引物由英潍捷基公司合成。

2 结果

2.1 CCCP 诱导的LC3 脂质化需要自噬关键基因Atg5 参与 在WT MEF 细胞中，用CCCP 处理细胞后，和对照组相比，CCCP 组能产生很多GFP-LC3的荧光小点，与Western blot 实验结果一致。说明LC3 脂质化，CCCP诱导了自噬的发生。在Atg5-KO MEF细胞中，CCCP不能诱导产生GFP-LC3 的荧光小点(见图1)，说明CCCP诱导LC3脂质化时需要Atg5的参与。

图1 CCCP诱导的自噬需要Atg5参与A：WT MEF和Atg5-KO MEF在完全培养基(CM)和CCCP(30 μM，6 h) 处理后GFP-LC3荧光小点的细胞图像分析，bar=10 μm；B: Western blot 检测相应的LC3-I和LC3-II的表达Fig.1 CCCP induced autophagy dependent of Atg5A:WT MEF, Atg5-KO MEF cells stably expressing GFP-LC3 were treated with complete medium(CM)or 30 μM of CCCP for 6 h. Fluorescent images were analyzed, bar=10 μm;B:Expression level of LC3-I and LC3-II of cell lysates were detected by Western blot

2.2 CCCP诱导非经典自噬不需要自噬关键基因ULK1、FIP200以及Beclin1的参与 在Beclin1-KD U251 细胞中，CCCP处理能诱导细胞产生GFP-LC3的荧光小点。在ULK1-KO MEF和FIP200-KO MEF细胞中，CCCP处理也能诱导细胞产生GFP-LC3的荧光小点。Western blot结果显示，在上述3种细胞中CCCP处理均能使LC3-I型转变为LC3-II，且比未处理组增加明显，见图2。说明CCCP诱导的非经典自噬不需要自噬关键基因ULK1、FIP200 和Beclin1的参与。

图2 CCCP诱导的自噬不依赖于Beclin 1、ULK1、FIP200A: Beclin 1-KD U251、ULK1-KO MEF以及FIP200-KO MEF在完全培养基(CM)和CCCP(30 μM，6 h)处理后GFP-LC3荧光小点的细胞图像结果，bar=10 μm；B： Western blot 检测相应的LC3-I和LC3-II的表达Fig.2 CCCP induced Beclin-1/ULK1/FIP200 independent autophagyA:Beclin 1-KD U251, ULK1-KO MEF, and FIP200-KO MEF cells stably expressing GFP-LC3 were treated with complete medium(CM)or 30 μM of CCCP for 6 h bar=10 μm;B:Expression level of LC3-I and LC3-II of different cell lysates were detected by Western blot

2.3 CCCP 诱导非经典自噬并不是通过影响LC3B的转录调控 在FIP200-KO MEF细胞中CCCP能诱导非经典自噬，那么CCCP是否通过调控LC3的转录诱导非经典自噬。荧光定量PCR结果显示，CCCP处理组(30 μM，6 h)和对照组相比，LC3B mRNA水平差异无统计学意义(见图3)。说明在FIP200-KO MEF细胞中，CCCP并不影响LC3 的转录调控。

图3 CCCP处理对LC3B mRNA水平的影响Fig.3 mRNA analysis of LC3B with or without CCCP treatment

2.4 CCCP 诱导的非经典自噬受渗透压影响 Western blot结果显示：在FIP200-KO MEF细胞中，CCCP 诱导的LC3脂质化可被水通道蛋白抑制剂Phloretin和AgNO3所抑制(见图4)。水通道蛋白抑制剂可改变膜的渗透压，这说明CCCP诱导非经典自噬可能受渗透压的调节。

图4 水通道蛋白抑制剂对CCCP诱导非经典自噬的影响A：FIP200-KO MEF中CCCP(30 μM，6 h)和水通道蛋白抑制剂Phloretin联合使用对LC3 蛋白表达的影响；B：FIP200-KO MEF 在CCCP(30 μM，6 h)和水通道蛋白抑制剂AgNO3(2 μM，6 h)联合使用对LC3 蛋白表达的影响**P<0.01Fig.4 Effect of water channel inhibitors on CCCP-induced non-canonical autophagyA: LC3 expression of FIP200-KO MEF cells treated with 30 μM of CCCP and 200 μM of Phloretin for 6 h;B: LC3 expression of FIP200-KO MEF cells treated with 30 μM of CCCP and 2 μM of AgNO3 for 6 h**P<0.01

3 讨论

CCCP作为一个传统强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，可促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失，常被用于线粒体损伤以及线粒体自噬的研究[6,9]。LC3是自噬体最常用的标记物[10]，本文用LC3形成的斑点和LC3脂化形式LC3-II的增加作为自噬的检测指标。不依赖于某些自噬相关基因的自噬，称之为非经典自噬，如Atg5/Atg7 不依赖性自噬[11]，ULK1/ULK2不依赖性自噬[12]，Beclin1不依赖性自噬[13]。根据前人的报道，LAP(LC3相关吞噬)的发生不依赖于ULK1/2-ATG13-RB1CC1/FIP200经典自噬的起始复合物，但仍需依赖于自噬相关蛋白ATG5和ATG7[14]，LAP也属于一种非经典自噬。近年关于自噬基因功能失调与一系列不同疾病的联系的相关报道逐年增多，如Crohn’s disease 与ATG16L1基因的变异相关[15]。现已有研究报道LAP与抗菌、清除死细胞、抗癌、免疫等密切相关[16-19]，所以发现诱导非经典自噬的药物以及研究非经典自噬的发生机制能为非经典自噬的生理功能奠定重要的基础。本研究发现自噬关键基因Atg5的缺失可以阻断CCCP 所诱导的自噬，同时发现CCCP诱导的自噬不能被自噬关键基因Beclin1、FIP200以及ULK1 所阻断，说明CCCP可以诱导非经典自噬。研究还发现CCCP并不影响LC3本身的mRNA水平，也就是说CCCP 诱导非经典自噬并不影响LC3的转录调控。有研究报道，氯喹诱导LAP 时受渗透压调节，渗透压失衡可诱导LAP的LC3脂质化[16]。所以，用影响渗透压的水通道蛋白抑制剂联合CCCP处理，发现水通道蛋白抑制剂也能抑制CCCP引起的LC3脂质化，说明CCCP诱导的非经典自噬也受渗透压调节。然而，CCCP诱导的非经典自噬是否受其他因素影响以及CCCP改变渗透压的具体机制还需要进一步研究。本研究确证了CCCP可以诱导非经典自噬，并发现渗透压失衡可能是调节该自噬的重要因素，拓宽了对CCCP功能的了解，为研究自噬发生过程与疾病的潜在联系提供了新的调控思路。

[1] Choi AM,Ryter SW,Levine B.Autophagy in human health and disease[J].N Engl J Med,2013,368(7):651-662.

[2] Klionsky DJ.The autophagy connection[J].Dev Cell,2010,19(1):11-12.

[3] Jiang P，Mizushima N.Autophagy and human diseases[J].Cell Res,2014,24(1):69-79.

[4] Dupont N, Codogno P.Non-canonical autophagy:facts and prospects[J].Curr Pathobiol Rep,2013,1(4):263-271.

[5] Narendra D,Tanaka A,Suen DF,et al.Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy[J].J Cell Biol,2008,183(5):795-803.

[6] Ding WX,Ni HM,Li M,et al.Nix is critical to two distinct phases of mitophagy,reactive oxygen species-mediated autophagy induction and parkin-ubiquitin-p62-mediated mitochondrial priming[J].J Biol Chem,2010,285(36):27879-27890.

[7] Chen D,Chen X,Li M,et al.CCCP-Induced LC3 lipidation depends on Atg9 whereas FIP200/Atg13 and Beclin 1/Atg14 are dispensable[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,432(2):226-230.

[8] Ding WX,Ni HM,Gao W,et al.Linking of autophagy to ubiquitin-proteasome system is important for the regulation of endoplasmic reticulum stress and cell viability[J].Am J Pathol,2007,171(2):513-524.

[9] Strappazzon F,Nazio F,Corrado M,et al.AMBRA1 is able to induce mitophagy via LC3 binding,regardless of PARKIN and p62/SQSTM1[J].Cell Death Differ,2015,22(3):419-432.[10] Klionsky DJ,Abdalla FC,Abeliovich H,et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy,2012,8(4):445-544.

[11] Nishida Y,Arakawa S,Fujitani K,et al.Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy[J].Nature,2009,461(7264):654-658.

[12] Cheong H,Lindsten T,Wu J,et al.Ammonia-induced autophagy is independent of ULK1/ULK2 kinases[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(27):11121-11126.

[13] Al Dhaheri Y,Attoub S,Ramadan G,et al.Carnosol induces ROS-mediated beclin1-independent autophagy and apoptosis in triple negative breast cancer[J].PLoS One,2014,9(10):e109630.

[14] Romao S,Munz C.LC3-associated phagocytosis[J].Autophagy,2014,10(3):526-528.

[15] Cadwell K,Liu JY,Brown SL,et al.A key role for autophagy and the autophagy gene Atg16l1 in mouse and human intestinal Paneth cells[J].Nature,2008,456(7219):259-263.

[16] Florey O,Gammoh N,Kim SE,et al.V-ATPase and osmotic imbalances activate endolysosomal LC3 lipidation[J].Autophagy,2015,11(1):88-99.

[17] Huang J,Canadien V,Lam GY,et al.Activation of antibacterial autophagy by NADPH oxidases[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(15):6226-6231.

[18] Martinez J,Almendinger J,Oberst A,et al.Microtubule-associated protein 1 light chain 3 alpha (LC3)-associated phagocytosis is required for the efficient clearance of dead cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(42):17396-17401.

[19] Sanjuan MA,Dillon CP,Tait SW,et al.Toll-like receptor signalling in macrophages links the autophagy pathway to phagocytosis[J].Nature,2007,450(7173):1253-1257.

(编校：吴茜)

Mechanism of CCCP-induced non-canonical autophagy

GAO Ying, LIU Ya-jun, CAI Xin-ran, LIU Pei-qingΔ, LI MinΔ

(National and Local United Engineering Lab of Druggability and New Drugs Evaluation, School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo identify the factors those regulate CCCP-induced non-canonical autophagy. MethodsDifferent cells expressing GFP-LC3 were treated with or without CCCP (30 μM) for 6 h. Fluorescent images were taken and cell lysates were analyzed by western blot assay. Real-time PCR was used to measure the mRNA levels of LC3B. FIP200-KO MEF cells were cultured and treated by 30 μM CCCP with or without water channel inhibitors, for 6 h. Cell lysates were analyzed by Western blot assay. ResultsCCCP could not induced autophagy in Atg5-KO MEF cells. CCCP could induce non-canonical autophagy in ULK1-KO MEF, FIP200-KO MEF, and Beclin1-KD U251. CCCP treatment in FIP200-KO MEF cells had no effect on the expression level of LC3B mRNA. We also found two distinct aquaporin water channel inhibitors could inhibit the generation of LC3 which was induced by CCCP. ConclusionCCCP induced non-canonical autophagy was Atg5-dependent, but Beclin1-, ULK1- and FIP200-independent. Osmotic imbalance could regulate CCCP-induce non-canonical autophagy.

Autophagy; osmotic imbalance; CCCP; LC3; MEF

广东省自然科学基金(S2013010015876)；博士点基金(20130171120049)

高瑛，女，硕士在读，研究方向：细胞自噬，E-mail：gaoyiying09@126.com；李民，通信作者，男，博士、副教授，研究方向：细胞自噬，E-mail：limin65@mail.sysu.edu.cn；刘培庆，共同通信作者，男，博士、教授，研究方向：心血管药理，E-mail：liupq@mail.sysu.edu.cn。

R329.2+7

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.04.08