林 杰，王旭荣，王 磊，张景艳，王学智，孟嘉仁，杨志强，李建喜



荷斯坦奶牛乳腺组织冻存及乳腺上皮细胞原代培养技术改进

林 杰，王旭荣，王 磊，张景艳，王学智，孟嘉仁，杨志强*，李建喜*

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，兰州730050）

摘 要：为了改进奶牛乳腺上皮细胞原代培养技术和探究乳腺组织冻存方法，选用24月龄无泌乳史荷斯坦奶牛，采用组织块种植法，通过侧置和倒置两种方式，分别从新鲜和冻存（8个月）的乳腺组织中分离培养奶牛乳腺上皮细胞。结果表明，侧置处理能使乳腺细胞爬出时间缩短1～2d，并改善组织块贴壁速度和效果；回收于前次培养后的乳腺组织块再分离培养，贴壁第2天即有乳腺上皮细胞爬出；一步冷冻（－80℃）液氮保存较大奶牛乳腺组织块，冻存液A（FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1）冻存的组织块存活率为50%，冻存液B（FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸钠贮存液＝10∶7∶2∶1）冻存的组织块存活率为56%。可见，作者建立的侧置处理法和组织块回收法可以用于奶牛乳腺上皮细胞的分离培养，可以缩短组织块种植法实验周期，冻存液中加入缓冲液HEPES/丙酮酸钠后有利于组织块生物活性保持。

关键词：乳腺上皮细胞；侧置处理；组织冻存；原代培养；奶牛

体外培养的奶牛乳腺上皮细胞适宜建立细胞模型，是开展生理、病理、药理等研究的重要实验材料。国外已有成熟永生化奶牛乳腺上皮细胞系，如MAC－T、BME－UV1［1－2］。国内也有永生化奶牛乳腺细胞系研究的报道，如朱佳杰、李吉霞、上官陶、代瑞等通过转染hTert、SV40T等获得永生化乳腺上皮细胞［3－6］。……