柯润辉，王丽娟，安红梅，黄新望，尹建军，宋全厚（1.中国食品发酵工业研究院，北京100015；2.国家食品质量监督检验中心，北京100015）



超高效液相色谱-串联质谱法直接测定白酒中8种甜味剂

柯润辉1，2，王丽娟1，2，安红梅1，2，黄新望1，2，尹建军1，2，宋全厚1，2
（1.中国食品发酵工业研究院，北京100015；2.国家食品质量监督检验中心，北京100015）

摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）测定白酒中8种甜味剂（安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜和甜菊糖苷）含量的分析方法。样品经蒸馏水稀释一定倍数后，过0.22 μm微孔滤膜，直接进入UPLC-MS/MS中分析检测。Waters HSS T3色谱柱为分析柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾电离源负离子模式下，采用多反应监测模式进行检测。结果表明，8种甜味剂在10～500 μg/L的范围内线性关系良好（相关系数r＞0.996），方法检出限在1～3 μg/L之间，基质加标回收率在89%～106%之间，相对标准偏差≤9%，均可达到白酒中痕量甜味剂的检测要求。该方法前处理简单，测定快速、准确、灵敏度高，非常适合白酒中多种甜味剂的快速筛查和定量分析。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱仪；白酒；甜味剂

优先数字出版时间：2016-02-25；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1725.003.html。

近年来，随着消费和认识水平的提高，食品的营养和健康逐步成为消费者关心的重点。因此，食品中各种添加剂的使用情况越来越受到人们的关注。甜味剂是一类十分重要的食品添加剂，用以改善食品口感和风味，由于其低热量、高甜度、适合糖尿病人食用等特点而成为蔗糖替代品在食品工业中广泛使用。国家标准《食品添加剂使用卫生标准》（GB 2760—2014）规定了可用于食品加工的甜味剂，包括甜蜜素、安赛蜜、木糖醇、阿力甜等的适用范围和添加限量［1］。食品添加剂在规定的剂量范围内使用对人无害，若超量使用，则可能引起各种形式的毒性表现，因此，必须对其使用量进行严格管理。

中国白酒历史悠久，是中华民族宝贵的文化遗产和特有的传统产品，深受消费者喜欢。为了保护我国传统产品，我国在食品安全国家标准中明确规定白酒不允许添加任何甜味剂［1］。但个别生产企业为了降低成本，掩盖其产品的口感缺陷，仍在生产和勾调过程中违规添加甜味剂，干扰了行业的健康发展。近些年来，国家有关部门在对全国白酒的抽检过程中发现，滥用甜味剂的现象时有发生。目前，国标检验方法中一次只能检测一种或两种添加剂［2］，测定多种成分时不得不频繁改变前处理方法和仪器条件，费时费力。随着食品中甜味剂复配使用的情况越来越普遍，为提高工作效率，方便监管部门和生产企业对白酒中甜味剂的日常监测，有必要研究对多种甜味剂同时进行测定的方法［3］，这不仅是技术发展的需求，也是实际应用的需求。

目前，文献报道白酒中甜味剂的检测方法较多，主要有离子色谱法［4］、气相色谱法［5］、液相色谱法［6-7］、气相色谱-质谱法［8］、液相色谱-质谱/质谱法［9-11］等，检测对象涉及多种甜味剂。经文献检索，目前尚未见到用液相色谱-串联质谱方法同时测定白酒中安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜、甜菊糖苷8种常见甜味剂的报道。由于液相色谱-串联质谱仪的高选择性与高灵敏度，其在甜味剂检测中的应用范围越来越广。本实验建立了超高压液相色谱-串联质谱仪同时测定白酒中8种常见甜味剂的方法，简便、快速、灵敏度高，为大规模的白酒监督抽查和企业日常监控提供及时准确可靠的技术手段。

1材料与方法

1.1材料、仪器与试剂

酒样：市售。

仪器设备：ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪-ACQUITY TQD电喷雾串联四极杆质谱仪（美国Waters公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（100 m× 2.1 mm×1.8µm）（美国Waters公司）；Milli-Q Reference超纯水发生器（美国Millipore公司）；0.22 μm有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。

试剂：甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；甲酸、乙酸（HPLC级，迪马科技有限公司）；乙酸铵（分析纯，迪马科技有限公司）；实验用水为Milli-Q超纯水。8种甜味剂标样：糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、甜菊糖苷（纯度＞98%，美国Sigma公司和加拿大TRC公司），阿力甜（纯度＞98%，加拿大TRC公司）。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制

分别准确称取10 mg（精确至0.1 mg）糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、甜菊糖和阿力甜标准品于10 mL棕色容量瓶中，用超纯水溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的标准储备液。阿斯巴甜在中性水溶液中易分解，配制时需加入少量乙酸（使溶液pH4.3左右）。将上述标准溶液置于4℃冰箱中保存，根据使用需要用流动相溶液逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.2.2样品前处理方法

准确吸取白酒样品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供UPLC-MS/MS测定。

1.2.3色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 m×2.1 mm× 1.8µm）；柱温为40℃；进样量：10 μL；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%乙酸水溶液；流速：0.35 mL/min；梯度洗脱程序：0 min，10%A；0～4 min，10%A～90%A；4.0～4.5 min，90%A；4.5～7.0 min，10%A。

1.2.4质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）模式；毛细管电压为2.90 kV；离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为400℃，流速为700 L/h；锥孔气流速为50 L/h。

2结果与讨论

2.1色谱和质谱条件的优化

2.1.1色谱条件的选择

实验考察了BEH C18柱和BEH HSS T3柱对8种甜味剂的分离效果，发现在相同的分离条件下，T3柱的分离效果更好。由于某些被测物极性较强，流动相的洗脱能力不宜过强，同时乙腈的毒性较甲醇大；又由于流动相进入质谱仪，添加一定量的缓冲盐可以增加响应值；所以考虑甲醇-水、甲醇-乙酸铵溶液、甲醇-甲酸水溶液3种流动相体系。以待测物质在色谱柱上的分离度、峰形、灵敏度等为考察指标对3种流动相体系进行了比较。结果表明，用0.1%乙酸-甲醇作为流动相时各物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性均优于0.1%甲酸-甲醇和5 mmol/L乙酸铵-甲醇。在流动相中加入0.1%的乙酸有助于［M+H］+准分子离子的形成，继续增加流动相中乙酸的含量，质谱响应基线噪音增加，灵敏度下降，故实验选用0.1%乙酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。

2.1.2质谱条件的选择

离子源为电喷雾电离源（ESI），采用注射泵直接连续进样方式进行全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰，再用惰性气体Ar轰击该母离子，获得其二级质谱图及相应子离子。结果发现，8种甜味剂在负离子模式中响应值及灵敏度均高于正离子模式，因此，本实验选择负离子电离模式。除甜蜜素和甜菊糖苷的母离子裂解时只得到1个碎片子离子外（表1），其余6种甜味剂均获得了丰富的碎片离子。利用多反应监测（MRM）模式对选定的定性和定量离子对进行质谱毛细管电压、碰撞能量、锥孔电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最强，所得最佳质谱条件参数见表1。在优化的色谱和质谱条件下8种甜味剂的总离子流（TIC）色谱图见图1。

表1　　8种甜味剂的质谱分析参数

图1　　 8种甜味剂混合标准溶液的总离子流色谱图（200 μg/L）

2.1.3样品前处理条件的选择

由于白酒含有高比例的乙醇，若直接进样分析，乙醇会影响8种甜味剂在反相C18柱上的保留时间和峰形，导致保留时间偏移，影响检测结果的准确性和重现性。为了消除乙醇对检测的影响，可采用加水稀释、氮吹或旋转蒸发的方法，考虑到氮吹和旋蒸操作相对复杂及耗时，本研究采用加水稀释的方式。综合考虑了乙醇浓度、色谱峰形和仪器响应值等因素，最终确定稀释倍数为5倍。

2.2方法的线性范围和检出限

将8种甜味剂混合标准储备液用甲醇∶水（1∶9，v/v）溶液稀释，分别配制成含量为10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L的混合标准工作液，按2.1所确定的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线。以目标组分的峰面积y对相应的质量浓度x绘制标准曲线，相关系数（r）都在0.996以上。用信噪比（S/N）为3确定方法的检出限（LOD），相关参数见表2。

2.3精密度和回收率

准确吸取空白白酒样品，用微量移液器准确加入一定量的8种甜味剂混合标准溶液，配制成100 μg/L浓度水平进行回收实验，按1.2节所述实验步骤进行处理和测定，进行6次重复实验，计算其回收率及相对标准偏差（RSD）。结果表明，白酒中8种甜味剂的回收率在89%～106%之间，相对标准偏差小于9%（表3）。方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求，可用于白酒中8种甜味剂的同时检测。

表2　　8种甜味剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

表3　白酒中8种甜味剂的添加回收率和相对标准偏差（n=6）

2.4实际样品的测定

按照本文建立的检测方法，对90个市售白酒样品进行了检测，每个样品重复测定3次，计算被测样品中各种甜味剂的含量。结果发现，4个样品中检测出甜蜜素，4个样品检出甜菊糖苷，2个样品检出纽甜，其中有2个样品检出2种甜味剂，其余5种甜味剂未检出。实际样品中各甜味剂检测浓度水平范围为100～1950 μg/L之间。

3　结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪直接测定白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜和甜菊糖苷8种甜味剂含量的快速测定和确证方法。应用本方法对白酒中的微量甜味剂进行检测，前处理步骤简单、分离度好、准确度和灵敏度高，能够满足白酒中多种痕量甜味剂残留的分析要求，与国标方法相比，大大提高了分析效率。本方法的建立为白酒中甜味剂的检测提供了可靠而准确的技术手段，对规范食品添加剂在食品中的使用行为具有重要意义。

参考文献：

［1］中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品添加剂使用标准：GB 2760—2014［S］.北京：中国标准出版社，2015.

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中图分类号：TS262.3；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0107-03

收稿日期：2015-11-13

作者简介：柯润辉（1980-），博士，高级工程师，主要研究方向为食品安全分析与检测技术，E-mail：runhuike@163.com。

DOI：10.13746/j.njkj.2015418

Simultaneous Determination of Eight Sweeteners in Baijiu by UPLC-MS/MS

KE Runhui1，2，WANG Lijuan1，2，AN Hongmei1，2，HUANG Xinwang1，2，YIN Jianjun1，2and SONG Quanhou1，2
（1. China National Research Institute of Food & Fermentation Industries，Beijing 100015；2. National Food Quality Supervision and Inspection Center，Beijing 100015，China）

Abstract：The method of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric（UPLC-MS/MS）had been developed for simultaneous determination of eight sweeteners in Baijiu as follows：liquor samples were diluted with distilled water，then filtered through 0.22 μm microporous membrane，and LC separation was performed on a Waters Acquity UPLC system with a HSS T3 column，and 0.1%（v/v）acetic acid-methanol solution were used as mobile phase for gradient elution，after LC separation，MS/MS was adopted for multiple reaction monitoring mode（MRM）. The calibration curves showed good linearity in the range of 10 μg/L to 500 μg/L with the correlation coefficients higher than 0.996. The limits of detection（LODs）were between 1 μg/L and 3 μg/L. The matrix recoveries were within 89%-106%and the relative standard deviations（RSDs）were lower than 9%（n=6）. Such method had the advantages including simple pretreatment，fast and accurate measurement，and high sensitivity，which was suitable for qualitative and quantitative measurement of sweeteners in Baijiu.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Baijiu；sweeteners