许　珂，王兴玲，刘艳丽

(1.郑州大学第三附属医院 生殖中心，河南 郑州 450052；2.河南中医学院第三附属医院，河南 郑州 450008)



大鼠卵巢组织两个自体移植部位移植效果的比较

许珂1,2，王兴玲1，刘艳丽1

(1.郑州大学第三附属医院 生殖中心，河南 郑州 450052；2.河南中医学院第三附属医院，河南 郑州 450008)

[摘要]目的探讨去势SD大鼠自体卵巢组织两种不同移植方法的效果比较。 方法按照移植部位不同将SD大鼠随机分为肾被膜下移植组、颈部皮下移植组和对照组，每组20只。记录各组手术所用时间、移植后大鼠动情周期变化，并给予HMG促排卵48 h后回收卵巢组织进行HE染色观察组织学变化和计算卵子存活率。结果肾被膜下组较颈部皮下组所用手术时间短，分别为(18.8±2.5) min和(20.7±2.8)min，P<0.05；肾被膜下组与颈部皮下组移植后大鼠动情周期出现率分别为81.25%与61.11%，差异有显著性意义(P<0.05)，大鼠恢复动情周期天数无差异。两组促排后大鼠移植部位卵巢组织回收率分别为：肾被膜下组81.3%，颈部皮下组55.6%，差异有显著性意义(P<0.05)。但两移植组回收卵巢组织卵泡存活数较对照组减少(均P<0.05)，两移植组间差异无显著性意义(P>0.05)。结论与颈部皮下移植相比，大鼠卵巢组织自体肾被膜移植可获得更好的效果。

[关键词]卵巢组织；自体异位移植；去势；SD大鼠；动情周期

[引用本文]许珂,王兴玲，刘艳丽.大鼠卵巢组织两个自体移植部位移植效果的比较[J].大连医科大学学报，2016,38(1)：24-27.

近年来，青春期和育龄期妇女恶性肿瘤病人逐年增加，但随着癌症诊断和治疗技术的进步，死亡率显著下降，生存期限大大延长。然而女性的卵巢对放化疗非常敏感，其生殖内分泌功能会受到辐射或药物毒性损伤。许多病人在接受放化疗以及妇科根治性手术后，出现卵巢功能衰竭。卵巢早衰(POF)会造成月经稀发、不孕、闭经，及因雌激素缺乏而造成心血管系统疾病和骨质疏松等[1]，严重影响女性患者的生活质量。病人愈后能否获得生育能力，是关系其生活质量的重要问题。这就使得卵巢内分泌功能和生育能力的保存越来越受到重视。

目前，国内外大量实验研究和初步临床应用已经证实通过自体移植卵巢有可能恢复患者的生育能力和内分泌功能[2]。然而，卵巢组织移植过程许多基础理论研究仍然处于初步阶段，移植后缺血再灌注损伤仍然是阻碍移植卵巢功能恢复的关键因素。有研究发现将卵巢组织移植到伤口愈合过程中形成的肉芽组织内，能减少组织的缺血损伤时间[3]。本实验将SD雌性大鼠新鲜卵巢组织分别自体移植到一侧肾被膜下和颈部皮下预制的肌层创面肉芽组织内，探讨大鼠两种不同移植部位的移植效果，以期为人类卵巢组织移植的开展应用奠定实验基础。

1材料和方法

1.1实验动物

SD雌性大鼠60只，6周龄，体重25～35 g，购于郑州大学实验动物中心，许可证号为SCXK(豫)2010-002。饲养于郑州大学第三附属医院实验动物中心，人工控温20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，给予营养颗粒饲料，自由饮水，1周后进行实验。40只先做去势手术之后再进行移植(肾被膜下移植组和颈部皮下移植组各20只)，另20只作为对照组不作任何处理。

1.2大鼠去势手术

采用背式卵巢去势：按0.1 mL/10 g 剂量腹腔注射0.5%的水合氯醛麻醉大鼠。将大鼠固定，碘伏常规消毒。在肋脊角水平，沿正中腰部切开一小口(2 mm)。沿肌肉走向切开肌肉进入后腹膜，循子宫分支找出卵巢，从输卵管处结扎卵巢动静脉，并切除卵巢。同法切除对侧卵巢。将切除的卵巢剪成碎片，置于0.9%生理盐水中待用。

1.3两种自体卵巢组织移植方法

1.3.1肾被膜下移植：沿子宫向腹腔深处找到肾脏，从肾上极用显微镊将切开的大鼠卵巢组织片塞入提起的一侧肾被膜下并将其推至肾脏下极，由于肾脏被膜有一定张力，组织放入后不需缝合，把肾脏送入腹腔原位后，依次缝合手术切口。

1.3.2颈部皮下移植：移植前2天将大鼠麻醉后用碘伏常规消毒颈背部皮肤，手术剪剪开约2 mm小口，肌层内用小弯钳钝性分离一创面，然后缝合切口。移植日将大鼠卵巢组织片置于颈部皮下预制的肌层创面肉芽组织内，缝线固定，缝合。

两移植组术后均给予青霉素4 IU/只腹腔注射，1次/d，共3 d。

1.4促排卵

移植2周后肌注人绒毛膜促性腺激素(HMG)10 IU/只，注射1次。对照组大鼠正常饲养，2周后肌注HMG 10 IU/只。

1.5观察指标

记录手术时间及手术结束后大鼠生存情况。术后1周，所有大鼠每日8：00行阴道脱落细胞涂片，室温干燥，于95%酒精中固定10～15 min，经巴氏染色后显微镜下观察动情周期。促排卵48 h将大鼠脱臼处死回收卵巢移植体，计算卵巢组织移植块回收率。将移植的卵巢组织进行HE染色，观察其组织学变化，卵泡存活数/HPF。

1.6统计学方法

利用SPSS17.0统计软件进行数据统计，实验数据计量资料采用t检验及单因素方差分析，率的比较采用卡方检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2结果

2.1两移植组大鼠手术时间及术后情况比较

肾被膜下组手术所用时间为(18.8±2.5)min， 颈部皮下组手术所用时间为(20.7±2.8)min，两组差异有显著性意义(P=0.026)。移植术后，肾被膜下组有4只大鼠死亡，颈部皮下组有2只大鼠死亡，对照组无大鼠死亡。

2.2各组大鼠动情周期情况比较

未去势对照组大鼠全部有规律的动情周期；肾被膜下移植组16只大鼠中13只出现动情周期，颈部皮下移植组18只中11只出现动情周期，动情周期出现率分别为81.25%与61.11%，差异有显著性意义(P<0.05)，但两组动情周期天数无差异。

2.3各组卵巢组织回收情况比较

术后存活大鼠移植部位卵巢组织回收，肾被膜下移植组回收率81.3%，颈部皮下移植组回收率55.6%，两组比较差异有显著性意义，P<0.05。

2.4各组移植后卵巢组织学检查及卵泡存活情况比较

回收卵巢移植体，可见移植体均生长增大，呈圆形或肾形凸起(图1)，表面见大量血管形成。移植组卵巢组织切片中卵泡形态与新鲜卵巢相近，结构正常，卵母细胞保持圆形，透明带完整，周围颗粒细胞形态正常(图2)。每高倍视野卵泡数比较，对照组较肾被膜下移植组和颈部皮下移植组卵泡数目更多(P=0.001)。而肾被膜下移植组和颈部皮下移植组间相比差异无显著性意义(P=0.092)，见表1。

肾被膜移植组，恢复动情周期的13只大鼠中有24只卵巢出现不同发育阶段的卵泡和排卵后出现的黄体；颈部皮下移植组，恢复动情周期的11只大鼠中有18只卵巢出现不同发育阶段的卵泡和排卵后出现的黄体；其余的卵巢和未恢复动情周期的大鼠均未见卵泡的发育，可见卵巢组织有坏死后增生或炎症浸润。

表1　3组大鼠存活卵泡计数

1)与对照组相比，P<0.05

图1　肾被膜下的卵巢移植体Fig 1 Ovary graft under the kidney capsulea:圆形；b:肾形

图2　新鲜卵巢与移植卵巢组织切片形态Fig 2 Sections tissue morphology of fresh ovarian and transplanted folliclesa:新鲜卵巢组织切片；b:移植卵巢组织切片。所示卵母细胞圆形；所示透明带完整；周围颗粒细胞形态正常

3讨论

随着卵巢移植技术和辅助生殖技术的发展，卵巢及其生殖细胞作为极珍贵的生殖资源备受人们的关注，卵巢组织冷冻及移植是目前最寄予期望的一项技术[4]。为了能够更好的利用和保存卵巢生殖细胞，卵巢移植技术不断得到完善，将成为延续和保存雌性生殖能力的一种有效方法[56]。1896年Knauer首次将自体卵巢移植在动物身上并获得成功[7]，1906年Carrel应用血管吻合方法进行卵巢移植，使移植的卵巢存活并成功创立了器官移植血管吻合技术[8]。随后相继成功在大鼠、兔、羊、猪、猕猴和人等都进行了卵巢移植。近年来卵巢移植技术更是在生物医学领域得到深入广泛的研究，并显示出良好的应用前景。

国内外卵巢移植的临床效果不尽令人满意，许多基本理论问题没有得到有效的阐明[9]，很多基础研究有待于进一步开展。本研究采用大鼠作为实验动物，是因其繁殖周期短、价格便宜且动情周期较短等，可进行大样本的重复实验。对于移植部位的选择上，为了提高移植后卵巢组织的存活率，人们常选择血供丰富的部位，如肝被膜下、肾被膜下和颈部皮下等，但是不同移植部位的结果并未显示卵巢组织存活率、卵泡发育和血清激素水平有明显的差别[10]。研究中人们发现宿主去势后可以提高卵巢组织的移植效果，这可能是由于卵泡生长与卵泡刺激素(FSH)关系非常密切所致[11]。有研究也证明促性腺激素是可以促进卵巢组织移植后血管生成与卵泡存活的[12]。把大鼠先去势再移植，其目的主要是取消大鼠性腺功能对其中枢的负反馈作用，使FSH分泌增加，进而改善移植效果。2012 年 Hayashi 等[13]研究发现雌性去势大鼠通过结合高压氧治疗可以明显改善自体卵巢组织异位移植的效果。

本研究发现，大鼠去势后自体移植肾被膜下较颈部皮下优点多。(1)肾被膜下移植的最重要优点是血供丰富，移植物易于成活。(2)肾被膜下移植比颈部皮下移植手术时间短，因进行颈部皮下移植时除了背部去势手术切口外，还需要在颈部另外剪开一个切口，移植后另行缝合增加了手术时间。(3)肾被膜下移植卵巢回收率明显高于颈部皮下移植组。可能由于移植于肾被膜下有包膜包裹，卵巢组织不容易游走；而移植于颈部皮下，虽然缝合于预制的肉芽组织中，还是容易游走，很难回收。(4)颈部皮下移植较肾被膜下移植多了手术切口，增加了术后感染风险。因此本研究认为肾被膜下较颈部皮下更适合作为动物模型中卵巢移植的部位。早在2000年就有研究认为肾被膜移植优于颈部皮下移植[14]，本研究也印证了此结论。

同时本研究也发现肾被膜下移植出血较多，操作难度较大，这就要求术者掌握熟练的手术技能，以提高移植成功率。

本研究显示大鼠卵巢组织自体移植到肾被膜下和颈部皮下后，都可见到窦卵泡形成并且可以获得GV期卵子；两组间卵泡存活率差异无显著性意义。这提示，新鲜大鼠卵巢组织进行肾被膜下及颈部皮下这两个部位移植效果可能相差不大。但是由于时间限制本研究只进行到观察卵泡及GV期卵子阶段，并没有进行授精及优胚率的计算。

综上所述，大鼠去势后进行卵巢组织自体移植，肾被膜下比颈部皮下手术更加快捷有效，两种部位移植后获得相似的卵泡生存率。移植后如何获得成熟卵子及移植是否影响胚胎的发育有待进一步研究。

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Effect of two methods of transplantation research on auto-transplantation of ovarian tissue in rats

XU Ke1,2，WANG Xing-ling1，LIU Yan-li1

(1.ReproductiveMedicalCancer,theThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China；2.TheThirdAffiliatedHospitalofTCM,Zhengzhou450008,China)

[Abstract]Objective To investigate the influence of two transplantation methods on auto-transplantation of mouse ovarian tissue in SD mice. Methods According to the operation methods，the mice were divided into three groups： kindey capsule transplantation group， neck subcutaneous transplantation group and control group(n=20). The operation time were recorded after operation.Vaginal smears to observe estrus cycle in mice，two weeks later giving HMG to stimulate ovarian oviposit， after 48 h recycling ovarian tissue and HE dyeing to observe histological changes and the follicle survival rate was recorded.Results Significantly lengthened operation time was observed in neck subcutaneous transplantation group than kindey capsule transplantation group[(20.7±2.8)min vs. (18.8±2.5)min，P<0.05]. Kindey capsule transplantation group and neck subcutaneous transplantation group mice appeared estrus rate were 81.25% and 61.11% respectively(P<0.05)，there was no difference between the two transplantation groups back estrus days. The recovery rate of kindey capsule group was 81.3% after giving HMG， and the recovery rate of the neck subcutaneous group was 55.6%(P>0.05).The follicle survival rates in the two transplantation groups were significantly less than control group (P<0.05)，while there was no significant difference between the two transplantation groups (P>0.05).Conclusion Kindey capsule is more suitable for auto-transplantation of mouse ovarian tissue than neck subcutaneous， auto-transplantation of mouse ovarian tissue kindey capsule can get better results.

[Key words]ovarian tissue；subcutaneous auto-transplantation；castration；mice；estrus cycle

作者简介:许 珂(1980-), 女,河南南阳人，主治医师。 E-mail: 2545016081@qq.com 通信作者:王兴玲,教授。 E-mail: wangxl208@126.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.01.06

[中图分类号]R711.75

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)01-0024-04

(收稿日期:2015-07-03；修回日期：2016-01-07)