王 磊，刘贵栋，刘 丽，刘玉婕，娄宏君，齐 超，肖洪彬*，迟文成

1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

2. 哈尔滨工业大学电气工程及自动化学院，黑龙江 哈尔滨 150001

健康和糖尿病大鼠红细胞荧光光谱非线性程度差异

王 磊1，刘贵栋2*，刘 丽1，刘玉婕1，娄宏君1，齐 超2，肖洪彬1*，迟文成1

1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

2. 哈尔滨工业大学电气工程及自动化学院，黑龙江 哈尔滨 150001

糖尿病是严重威胁人类健康的慢性疾病之一，对其进行早期诊断尤为重要。由于糖尿病病程的发展会对血液中红细胞的结构和功能产生影响，因此利用红细胞荧光光谱在特征峰位和峰高等方面的差异性，可以对糖尿病状态进行诊断。在选取光谱信号的差异性作为特征向量方面，可以采用荧光光谱信号的非线性程度作为特征向量。为更好地描述荧光光谱信号的非线性，采用延迟向量方差(DVV)法描述信号的非线性程度。采用迭代幅度匹配傅里叶变换(IAAFT)法产生原始数据的替代数据，通过比较原始数据与替代数据的延迟向量方差确定原始数据的非线性特征。以原始数据目标方差为横坐标，以其替代数据目标方差为纵坐标，画出延迟向量方差散布图。健康大鼠红细胞荧光光谱的延迟向量方差散布图与其对角线几乎重合，说明健康大鼠红细胞荧光光谱非线性程度较低；而糖尿病大鼠红细胞荧光光谱的延迟向量方差散布图偏离其对角线，说明糖尿病大鼠红细胞荧光光谱非线性程度较高，并且氨基酸对应的光谱段非线性程度更深。据此，提出健康和糖尿病荧光光谱之间的非线性差异程度可以作为糖尿病早期诊断的特征之一。

糖尿病；红细胞；荧光光谱；延迟向量方差

引 言

糖尿病是世界三大严重威胁人类健康的疾病之一，近年来发病率呈上升趋势。目前全世界糖尿病患者已达3亿，其中95%的患者为Ⅱ型糖尿病患者。对糖尿病的早诊断、早治疗至关重要。糖尿病病程发展伴随着血糖、血脂等物质的代谢紊乱，在此过程中不规则的代谢产物会对血细胞产生负面影响，而血液中含量最多的细胞就是红细胞，因此红细胞的结构和功能的变化可以反映糖尿病对细胞的破坏作用，从而为诊断和治疗糖尿病提供辅助依据。研究表明，利用红细胞荧光光谱在特征峰位和峰高的差异可以辅助诊断高黏血症[1]。因此，糖尿病状态下和健康状态下红细胞荧光光谱存在的差异也可以作为辅助诊断糖尿病的依据。在利用信号差异作为特征量方面，可以利用信号的非线性特征作为特征量[2]。在描述信号非线性特征方面，延迟向量方差(DVV)法[3]是描述信号非线性特征的有效方法，该方法通过比较被测信号与其替代数据的方差确定被测信号的非线性特征。利用DVV法分析糖尿病和健康大鼠红细胞荧光光谱非线性程度的差异，从而为糖尿病的早期诊断和治疗提供辅助依据。

1 实验部分

1.1 仪器

实验所用荧光分光光度计是日本岛津公司生产的RF-5301PC，以氙灯为激发光源，扫描范围为300～700 nm，激发光狭缝宽度和发射光狭缝宽度均为1.5 nm。以440 nm波长为激发光，测量健康大鼠和糖尿病大鼠红细胞荧光光谱。每检测一份样品后，用95%乙醇和去离子水洗涤样品池。

1.2 样品制备

采用Srinivasan的STZ造模法[4]对雄性SD大鼠进行Ⅱ型糖尿病模型的诱导。雄性SD大鼠共30只，平均体重为200 g，随机分为2组：糖尿病模型组和健康对照组。

STZ模型诱导：对SD大鼠每日给予高脂饲料(脂肪含量占58%、蛋白质25%、其余组成为碳水化合物)诱导，诱导时间为30天，随后给予小剂量STZ(35 mg·kg-1)腹腔注射。注射7日后，测量大鼠空腹血糖值，糖尿病模型组大鼠空腹血糖显著高于对照组，分别为(17.1±0.5)mmol·L-1和(5.1±0.2)mmol·L-1，随机血糖也显著高于对照组，提示造模成功。

红细胞悬浮液制备：实验所用血液样品来自糖尿病组和健康组大鼠，经眼眶取血，取出一部分加5%肝素抗凝获得全血溶液，加入适量生理盐水，经3 000 r·min-1的高速分离机离心10 min，加入pH 为 7.4，0.01 mol·L-1的PBS缓冲液(Biotopped Life Science公司)重悬、洗涤以去除棕黄色血膜层和血清层，洗涤3次，分离出纯净的红细胞溶液待用。

1.3 数据分析

延迟向量方差法是建立在替代数据法的基础上的。替代数据法由Theiler等[5]提出，其主要思想是首先指定某种线性随机过程为零假设，并依据该假设产生相应一组替代数据，然后分别计算比较原始数据和替代数据集的检验统计量，如果原始数据算得的值与替代数据集的值有显著差异，则拒绝该零假设，说明原始数据中存在非线性成分。产生替代数据的方法主要有随机相位(PR)法和迭代幅度匹配傅里叶变换(IAAFT)法。IAAFT法产生的替代数据更接近原始数据，因此采用IAAFT法产生替代数据。Gautama等[3]提出的延迟向量方差法通过比较原始数据及其替代数据的延迟向量方差确定原始数据的非线性特征。该方法以标准距离为横坐标，目标方差为纵坐标得到原始数据及替代数据在不同标准距离下的DVV分布图。如果数据是非线性的，原始数据与替代数据的DVV分布图应有偏差。若以原始数据目标方差为横坐标，以其替代数据目标方差为纵坐标，可以得到更为直观的DVV散布图。如果DVV散布图曲线与其对角线重合，说明原始数据是线性的；反之，DVV散布图曲线偏离对角线，说明原始数据是非线性的。

2 结果与讨论

2.1 光谱分析

用440 nm激发光检测红细胞样品，得到健康组、糖尿病组红细胞典型荧光光谱如图1所示。从图中可以看出，对于正常红细胞，在300～700 nm波长范围内，存在两个荧光特征峰，峰位分别在340和690 nm处，两个峰的强度之比约为1.91。而对于糖尿病红细胞，在300～700 nm波长范围内，也存在两个荧光特征峰，峰位分别在329和673 nm处，两个峰的强度之比约为0.57。健康红细胞在690 nm处的荧光峰非常弱，而糖尿病红细胞在673 nm处荧光峰较强。糖尿病红细胞荧光峰与健康红细胞荧光峰相比，出现蓝移。340 nm处的荧光峰是氨基酸的特征峰，而690 nm处的荧光峰为卟啉类物质的特征峰。荧光光谱图说明，糖尿病大鼠红细胞中氨基酸含量稍微高于健康红细胞中氨基酸含量，而卟啉含量明显高于健康大鼠。由于卟啉是合成血红蛋白的重要原料，糖尿病状态下，血红素合成代谢异常，导致大量卟啉不能与铁结合，卟啉堆积。

图1 大鼠红细胞荧光光谱

2.2 光谱非线性程度差异

图2为利用DVV散布图法分析健康和糖尿病大鼠红细胞荧光光谱的非线性结果。由图2(a)和(b)可见，健康大鼠的DVV散布图曲线与对角线偏差较小，说明所分析信号的非线性程度较低。由图2(c)和(d)可见，糖尿病大鼠DVV散布图曲线明显偏离对角线，说明糖尿病大鼠红细胞荧光信号非线性程度较高。比较图2(c)和(d)可知，300～435 nm段散布图曲线偏离对角线更多，说明该段荧光光谱非线性程度更高。300～435 nm段光谱反映了红细胞氨基酸含量改变的情况，由此可知，糖尿病红细胞氨基酸含量的变化出现非线性。健康组和糖尿病组30只大鼠的红细胞荧光光谱都具有上述特点。由于成熟红细胞内不存在蛋白质的合成代谢过程，氨基酸含量的变化很可能反映了红细胞膜结构和功能的变化，其非线性程度加深进一步说明了红细胞膜正常的结构和功能已被打破。健康大鼠和糖尿病大鼠300～435 nm段光谱的散布图曲线差异明显，因此该段光谱的非线性特征可以作为辅助诊断糖尿病的特征之一。

图2 健康大鼠和糖尿病大鼠红细胞荧光光谱非线性分析结果

3 结 论

利用延迟向量方差法研究了健康大鼠和糖尿病大鼠红细胞荧光光谱信号的非线性程度差异。研究结果表明，糖尿病大鼠红细胞光谱信号非线性程度比健康大鼠红细胞光谱信号高，尤其是氨基酸所对应的光谱信号非线性程度更高。因此，通过DVV法得到的荧光光谱的非线性特征可以作为糖尿病辅助诊断的依据。

[1] ZHAO Yan, CHEN Li-na, ZHANG Liang-cai, et al(赵 妍，陈丽娜，张良才，等). Journal of Harbin Medical University(哈尔滨医科大学学报), 2008, 42(3): 224.

[2] David J C, Frederick M B, Kenneth R L, et al. IEEE Trans. on Biomedical Engineering, 1995, 42(4):411.

[3] Gautama T, Mandic D P, Marc M. IEEE Trans. on Biomedical Engineering, 2004, 51(5): 728.

[4] Srinivasan K, Viswanad B Lydia Asrat. Pharmacological Research, 2005, 52: 313.

[5] Schreiber T, Schmitz A. Physica D, 2000, 142(3): 346.

(Received Jun. 26, 2015; accepted Oct. 30, 2015)

*Corresponding authors

Difference of Nonlinear Degree between Healthy and Diabetic Rat Erythocyte Fluorescence Spectrum

WANG Lei1, LIU Gui-dong2*, LIU Li1, LIU Yu-jie1, LOU Hong-jun1, QI Chao2, XIAO Hong-bin1*, CHI Wen-cheng1

1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

2. School of Electrical Engineering and Automation, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China

Diabetes mellitus is one kind of chronic diseases which seriously threaten human health. It is very important to diagnose in the early stage. With the development of diabetes, the structure and function of erythrocyte in the blood will change. So the peak position and peak height of erythrocyte fluorescence spectrum are different. These differences can be used to determine the status of diabetes. In the selection of the difference of spectral signal as the feature vector, the nonlinear degree of fluorescence spectrum can be used as the feature vector. In order to describe the nonlinearity of the fluorescence spectrum signal, the nonlinear degree of the signal is described with the delay vector variance (DVV) method. By using the method of iterative amplitude adjusted Fourier transformation (IAAFT) to generate surrogate data of raw data, the nonlinear characteristic of the raw data is determined by comparing the DVV of the original data and the surrogate data. The variance of the original data is the horizontal coordinates, and the variance of the surrogate data is the longitudinal coordinates, thus the DVV scatter plot is drawn. The DVV scatter plot of healthy rat erythrocyte fluorescence spectrum is almost coincident with its diagonal, which means the nonlinear degree of healthy rat erythrocyte fluorescence spectrum is lower. The DVV scatter plot of diabetic rat erythrocyte fluorescence spectrum deviates from its diagonal, which means the nonlinear degree of healthy rat erythrocyte fluorescence spectrum is higher, also the corresponding amino acid spectrum nonlinearity is deeper. Therefore, it is proposed that the nonlinear difference between the healthy and diabetic fluorescence spectrum can be used as a feature of early diabetes diagnosis.

Diabetes; Erythrocyte; Fluorescence spectrum; Delay vector variance

2015-06-26，

2015-10-30

国家自然科学基金项目(81173186, 61178066)资助

王 磊，1983年生，黑龙江中医药大学博士研究生 e-mail: 86832408@163.com *通讯联系人 e-mail: gtomasd@hit.edu.cn；hrbxiaohongbin@126.com

O433.4

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)10-3207-04