谢玲红 顾栋桦

1.浙江省湖州市计划生育宣传技术指导站(313000)；2.浙江省湖州市中心医院

·临床研究·

宫颈液基细胞学样本中DAPK基因甲基化的检测及临床意义

谢玲红1顾栋桦2

1.浙江省湖州市计划生育宣传技术指导站(313000)；2.浙江省湖州市中心医院

目的：探讨在液基细胞学样本中检测宫颈鳞状细胞癌及其癌前病变的DAPK基因的甲基化临床意义。方法：收集2014年6月～2015年6月在本单位就诊或体检妇女的宫颈液基细胞学检查样本231例，在满足细胞学诊断后，用甲基化特异性聚合酶链反应检测样本中DAPK基因的甲基化状态，同时做宫颈组织病理学检查。结果：总体样本中宫颈液基细胞学DAPK基因的甲基化率为16.9%(39/231)，NILM、ASC-US、LISL、HISL、SCC各组中，DAPK基因的甲基化率分别为3.8%(2/53)、3.9%(2/52)、13.8%(8/58)、37.1%(23/62)、66. 7%(4/6)，HISL组和SCC组基因甲基化率高于NILM、ASC-US和LISL组。根据宫颈组织病理学诊断结果，宫颈炎、宫颈湿疣、宫颈上皮内瘤变(CIN)、鳞状细胞癌(SCC)各组中，DAPK基因的甲基化率分别为3.6%(2/55)、4.0%(2/50)、24.8%(28/113)、53.9%(7/13)，SCC组和CIN组DAPK基因甲基化率高于宫颈炎组和宫颈湿疣组；SCC组基因甲基化率高于CIN组。CINⅢ组DAPK基因甲基化率高于CINⅠ及CINⅡ组，而CINⅠ及CINⅡ组间无统计学差异。结论：宫颈液基细胞学样本中，SCC和HISL的DAPK基因的甲基化率相对较高，临床上可以利用少量液基细胞学检测样本，作为诊断宫颈癌及癌前病变的辅助诊断指标。

甲基化；DAPK基因；宫颈液基细胞

宫颈癌是我国最常见的女性恶性肿瘤之一[1]。宫颈脱落细胞学检查作为早期筛查方法，能够发现宫颈癌的早期病变，但非宫颈癌诊断的金标准，其准确率有待进一步提高。利用分子生物学方法检测宫颈脱落细胞以提高细胞学诊断效果，对促进宫颈癌早期病变筛查具有重要意义。死亡蛋白相关激酶(DAPK)是调节细胞凋亡的重要蛋白，可以通过多种途径来诱导细胞进入凋亡[2]。有研究表明，在许多肿瘤组织中DAPK基因启动子区域存在高频率的甲基化状态[3-6]，宫颈癌组织中DAPK基因也存在着高甲基化状态，并且DAPK基因的甲基化可以做为一个宫颈癌预后判断的标志[7-8]。本研究应用甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)方法检测宫颈液基细胞学样本中的DAPK基因的甲基化状态，探讨其对宫颈癌及早期病变的诊断价值以及临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2014年6月～2015年6月在湖州市中心医院及市计划生育指导站就诊或体检妇女的宫颈液基细胞学检查样本，平均年龄43(21～65)岁。细胞学诊断采用TBS分类系统，均有宫颈组织病理学诊断。

1.2 方法

将所有宫颈液基细胞学检查样本置于细胞保存液(Hologic公司，美国)中，样本用于液基细胞病理学诊断后；剩余部分置4℃保存，用于DAPK基因甲基化的检测。

1.2.1 DNA的提取及修饰 DNA提取使用美国QIAGEN公司的DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤操作，提取的DNA样本经SmartSpec plus核酸蛋白测定仪(BIO-RAD公司，美国)测定浓度后，置-20℃冰箱保存。取2μg细胞DNA加入50μl的0.2mmol/L NaOH溶液中，37℃孵育10min，再加入3 mol/L亚硫酸氢钠(PH 5.0)520μl与10 mmol/L氢醌30μl混合液，50℃孵育16h进行碱基修饰。修饰后的DNA用DNA纯化试剂盒(上海生工公司)纯化，并测定浓度后在-20℃保存。宫颈癌细胞株SiHa细胞DNA做为阳性对照，空白液基细胞保存液做为阴性对照。

1.2.2 PCR检测 DAPK甲基化基因的引物：上游引物 5'-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3'；下游引物 5'-CCC TCC CAA ACG CCG A-3'。 DAPK非甲基化基因的引物：上游引物 5'- GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3'；下游引物 5'- CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3'。PCR扩增产物长度106bp。引物由上海生工公司合成。PCR扩增体系和反应条件：PCR扩增体系包括10×PCR Buffer 2μl、MgCl2(25mmol/L) 2μl、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)混合物(2mmol/L) 2μl、上游引物(10μmol/L)2μl、下游引物(10μmol/L)2μl、Taq酶 0.2μl、模板DNA 4μl，加灭菌水至20μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，38个循环后，72℃延伸10min，至4℃结束。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果。

1.3 统计分析

数据用SPSS13.0软件进行处理分析，各组间比较使用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本收集情况

共收集样本231例，其中高度上皮内病变(HISL)62例，低度上皮内病变(LISL)58例，意义不明的不典型鳞状细胞(ASC-US)52例，未见上皮内病变/恶性细胞(NILM)53例，鳞状细胞癌(SCC) 6例。

2.2 标本中DAPK基因的甲基化检测

样本中DAPK基因经甲基化引物扩增后，在琼脂糖凝胶上可观察到106bp电泳条带。由于样本中混有正常的上皮细胞和其它细胞，且DAPK基因为杂合性甲基化状态，所以用非甲基化引物仍可扩增出同样大小的电泳条带。而不存在DAPK基因甲基化的样本中，只能观察到非甲基化引物扩增的条带(图1)。在231例样本中共发现39例样本存在DAPK基因的甲基化状态，总样本的DAPK基因甲基化率为16.88%。

2.3 不同细胞学诊断中DAPK基因的甲基化情况

不同细胞学诊断组织中DAPK基因甲基化率见表1。NILM组、ASC-US组与LISL组间基因甲基化率无统计学差异(P均>0.05)，HISL组和SCC组基因甲基化比例均高于NILM组(χ2=18.65、P=0.00，χ2=23.34、P=0.00)和ASC-US组(χ2=18.26、P=0.00，χ2=22.89、P=0.00)，HISL组和SCC组基因甲基化比例也高于LISL组(χ2=8.49、P=0.00，χ2=9.98、P=0.00)，HISL组和SCC组间无差异(χ2=1.998、P=0.16)。

U非甲基化引物PCR产物 M甲基化引物PCR产物

图1 DAPK基因的甲基化特异性PCR检测

2.4 不同病理学诊断组织中DAPK基因甲基化情况

不同病理学诊断组织中DAPK基因的甲基化率见表1。 DAPK基因甲基化率在宫颈炎组与宫颈湿疣组之间无统计学差异(χ2=0.01，P=0.92)，CIN组高于宫颈炎组和宫颈湿疣组(χ2=11.27，P=0.00；χ2=9.99，P=0.00)，SCC组也高于宫颈炎组和宫颈湿疣组(χ2=23.08，P=0.00；χ2=20.94，P=0.00)，并高于CIN组(χ2=4.91，P=0.03)。CINⅢ组中甲基化率高于CINⅠ及CINⅡ组(χ2=11.31，P=0.00；χ2=4.04，P=0.04)，而CINⅠ与CINⅡ组间甲基化率无差异(χ2=1.45，P=0.23)。见表1。

表1 不同诊断方法下诊断结果及DAPK基因甲基化情况(例)

3 讨论

宫颈癌的发生和发展是一个多步骤、多因素影响的复杂过程。肿瘤的形成与基因功能的表达失调有关，既有癌基因的异常激活，也有抑癌基因的抑制失活，基因启动子的甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制[9]。DAPK是调节细胞凋亡的重要蛋白，可以通过多种途径来诱导细胞进入凋亡[2]。赵先兰等[10]对宫颈组织研究发现，在宫颈炎-CIN-鳞状细胞癌的疾病谱中DAPK基因的甲基化率呈明显增高趋势，认为DAPK基因的甲基化在宫颈癌的发生、发展过程中可能起着重要作用。但目前对宫颈癌DAPK基因的甲基化研究大多以组织材料为主，而采用宫颈脱落细胞研究较少。本研究在液基细胞学样本中成功检测到DAPK基因甲基化状态。在临床检验工作中许多液基细胞学样本在制作完液基薄片后常有剩余，而PCR是一种较敏感的甲基化检测方法。因此，在临床实际工作中对液基细胞学样本检测DAPK基因甲基化是可行的。

本研究检测结果显示，在宫颈炎、宫颈湿疣、宫颈CIN、宫颈鳞状细胞癌病理诊断下，其DAPK基因的甲基化率不尽相同，在CIN病变中明显升高，提示DAPK基因的甲基化可能是宫颈鳞癌发生过程中的早期状态。在宫颈上皮内瘤变中，CINⅢ与宫颈鳞癌的关系更为密切，而CINⅢ病变更易发展为鳞状细胞癌。本研究结果显示，CINⅢ组DAPK基因的甲基化率明显高于CINⅠ及CINⅡ组，而细胞病理诊断HISL的病变包含了CINⅡ和CINⅢ两种病变，所以如果检测到DAPK基因存在甲基化状态，同样是HISL的患者可能更需要得到临床的重视。因此，利用液基细胞学样本检测DAPK基因的甲基化对宫颈病变的诊断具有一定的临床应用价值。

综上所述，甲基化特异性PCR在宫颈液基细胞学样本中能够检测到DAPK基因的甲基化状态，且该检测对在宫颈癌及癌前病变的诊断具有一定的辅助诊断价值。

[1] Zheng R, Zeng H, Zhang S, et al. National estimates of cancer prevalence in China, 2011[J]. Cancer Lett. 2016, 370(1):33-38.

[2] Chen HY, Lee YR, Chen RH.The functions and regulations of DAPK in cancer metastasis[J].Apoptosis,2014, 19(2):364-370.

[3] Kristensen LS, Asmar F, Dimopoulos K, et al.Hypermethylation of DAPK1 is an independent prognostic factor predicting survival in diffuse large B-cell lymphoma[J].Oncotarget,2014, 5(20):9798-9810.

[4] Zhang J, Yu XL, Zheng GF,et al.DAPK promoter methylation status correlates with tumor metastasis and poor prognosis in patients with non-small cell lung cancer[J].Cancer Biomark,2015, 15(5):609-617.

[5] Mittag F, Kuester D, Vieth M,et al.DAPK promotor methylation is an early event in colorectal carcinogenesis[J].Cancer Lett,2006, 240(1):69-75.

[6] Pierini S, Jordanov SH, Mitkova AV,et al.Promoter hypermethylation of CDKN2A, MGMT, MLH1, and DAPK genes in laryngeal squamous cell carcinoma and their associations with clinical profiles of the patients[J].Head Neck,2014, 36(8):1103-1138.

[7] Kalantari M, Osann K, Calleja-Macias IE,et al.Methylation of human papillomavirus 16, 18, 31, and 45 L2 and L1 genes and the cellular DAPK gene: Considerations for use as biomarkers of the progression of cervical neoplasia[J].Virology,2014, 448:314-321.

[8] Yang N, Nijhuis ER, Volders HH,et al.Gene promoter methylation patterns throughout the process of cervical carcinogenesis[J].Cell Oncol,2010, 32(1-2):131-143.

[9] Fang J, Zhang H, Jin S. Epigenetics and cervical cancer: from pathogenesis to therapy[J].Tumour Biol,2014, 35(6):5083-5093.

[10] 赵先兰, 孟志英, 乔玉环,等.宫颈癌组织中DAPK 基因启动子甲基化的研究[J].癌症, 2008, 27( 9) : 919- 923

[责任编辑：董 琳]

Detection of DNA methylation of DAPK gene in cervical liquid-based cytology specimens and its clinical significance

XIE Linghong1, GU Donghua2

1.Publicity&EducationTechnicalAdvisingCenterforFamilyPlanningofHuzhouCity,Zhejiang313000；2.HuzhouCityCentralHospital

Objective: To explore the clinical significance of DAPK gene methylated in detecting squamous cell carcinomas and squamous intraepithelial lesions of cervical liquid-based cytology specimens. Method: From June 2014 to June 2015, 231 liquid based cervical cytology samples from women who had visited hospital or had

physical examination were collected. After Cytological diagnosis, the residual specimens were used to examine methylation of DAPK gene by methylation-specific polymerase chain reaction approach. Result: The total rate of DAPK gene methylation was 16.9% (39/231). Rate of DAPK gene methylation in NILM group, ASC - US group, LISL group, HISL group, or SCC group was 3.8% (2/53), 3.9% (2/52), 13.8% (8/58), 37.1% (23/62), 66.7% (4/6), respectively. The rate of DAPK gene methylation in SCC or HISL group was significantly higher than that in NILM, ASC-US or LISL group. According to cervical biopsy specimens examination, the rate of DAPK gene methylation in chronic cervicitis group, cervical condylomata group, CIN or SCC group was 3.64%(2/55), 4.00%(2/50), 24.78%(28/113), 53.85%(7/13), respectively. The rate of DAPK gene methylation in SCC group or CIN group was significantly higher than that in chronic cervicitis or cervical condylomata group, and the rate of DNA methylation in SCC group was higher than that in CIN group. For CIN samples, The rate of DAPK gene methylation was significantly in CINⅢ group was higher than that in CINⅠgroup and CINⅡgroup, but there was no significant difference between CINⅠgroup and CIN Ⅱgroup. Conclusion: In liquid based cervical cytology samples, The DNA methylation of DAPK gene in HSIL group or SCC group is higher, so detection of DAPK gene methylation can be as an auxiliary diagnostic indicator to cervical cancer and precancerous lesions.

Methylation ；DAPK gene；Cervical liquid-based cytology

2016-05-23

2016-08-02

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.10