蔡永豪，徐雪姑，林佩珍，郁引飞

(温州医科大学附属眼视光医院 药剂科，浙江 温州 325000)

HPLC法测定夏天无滴眼液中原阿片碱的含量

蔡永豪，徐雪姑，林佩珍，郁引飞Δ

(温州医科大学附属眼视光医院 药剂科，浙江 温州 325000)

目的 建立测定夏天无滴眼液中原阿片碱含量的HPLC法。方法 采用ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)色谱柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液 (25:75)为流动相，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长290 nm，进样量20 μL。结果 在该色谱条件下，原阿片碱在浓度14.2～142 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.9999,n=9),加样回收率为104.5%，RSD为2.47%，日内和日间精密度RSD均小于1%(n=5)，样品在24 h内稳定。结论 本方法简单，结果准确可靠，重复性好，可以用于测定夏天无滴眼液中原阿片碱的含量。

夏天无滴眼液；原阿片碱；HPLC；含量测定

夏天无滴眼液主要功效为活血明目舒筋。用于血瘀筋脉阻滞所致的青少年远视力下降、不能久视；青少年假性近视症见上述症候者。成份包含原阿片碱、四氢巴马汀、球紫堇碱，以及其它少量各种植物碱。其主要成份普鲁托品(原阿片碱)能直接松弛平滑肌，解除睫状肌的紧张，其解痉作用比阿托品弱,但无阿托品那样的散瞳及升高眼压的副作用。中国药典采用检测原阿片碱的含量进行夏天无滴眼液的质量控制，文献报道的原阿片碱等生物碱的含量测定方法有薄层扫描法[1-2]、毛细管电泳法[3]、HPLC法[4-10]、LC/MS法[11]等。薄层扫描法操作繁琐,容易产生误差。毛细管电泳法分离能力较弱，并且对pH值要求较高。液质联用仪器使用成本较高。HPLC法能快速分离并检测原阿片碱，且方法灵敏、准确，重复性好。但存在流动相配制复杂，样品处置过程复杂，测定时仪器稳定时间长等缺点[4-10]。本研究在文献[4-11]的基础上，摸索建立了一种更简便、快速、准确的测定夏天无滴眼液中主要成份原阿片碱含量的高效液相色谱方法，在实际样品的含量分析中取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Aglient1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，色谱柱为ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)；FA1104型电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；灭菌注射用水(四川科伦药业)；原阿片碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110853-201003，含量：99.9%)；夏天无滴眼液(江西珍视明药业，批号：141101，150301，150901，规格：10 mL)；乙腈、三氟乙酸为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件及系统适应性：色谱柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸(25:75)，流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：290 nm；进样量：20 μL。主峰的拖尾因子小于2.0，理论板数按原阿片碱色谱峰计算不低于3000。

1.2.2 溶液的配制

① 对照品储备液的配制：精密称取五氧化二磷减压干燥器中干燥24 h的原阿片碱对照品7.1 mg，置25 mL容量瓶中，加入流动相溶解并定容至刻度，摇匀、静置。既得原阿片碱浓度为284 μg/mL的对照品储备液。

② 供试品溶液的配制：精密量取夏天无滴眼液7.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入流动相稀释并定容至刻度，摇匀、静置。即得原阿片碱浓度为281.25 μg/mL的夏天无供试品溶液。

1.2.3 方法学验证

① 专属性试验：在色谱条件下，分别记录对照品溶液、供试品溶液色谱图。

② 线性关系考察：精密量取对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释到刻度，摇匀，即得浓度为：14.2、28.4、42.6、56.8、71、85.2、99.4、113.6、142 μg/mL系列溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，将原阿片碱峰面积(A)与浓度(C)进行回归分析。

③ 精密度试验：选取低、中、高3种浓度的原阿片碱对照品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样分析，1 d内重复测定5次，考察日内精密度；连续测定5 d，考察日间精密度。

④ 加样回收率试验：分别精密量取夏天无滴眼液1 mL置于15个10 mL容量瓶中。精密量取原阿片碱对照品储备液1.2、1.5、1.8 mL各5份，分别置于上述10 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，按照“1.2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，计算回收率。

⑤ 耐用性试验：在试验中对流动相乙腈-0.1%三氟乙酸比例(23.7:76.3、25:75、26.3:73.7)、柱温(25 ℃、30 ℃、 35 ℃)、 流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)条件进行考察。

⑥ 样品含量测定：精密吸取夏天无滴眼液，稀释20倍，按照“1.2.1”项下条件进样测定峰面积，将测得峰面积代入回归方程按外标法计算样品中原阿片碱的含量。

⑦ 稳定性试验：以批号150301的夏天无滴眼液按“1.2.3⑥”项下方法制备供试品溶液并于0、2、4、8、10、12、24 h进样，进行测定。

2 结果

2.1 方法学验证

2.2.1 专属性考察结果：结果原阿片碱的保留时间约为6.2 min，样品溶液中主峰与其余各峰分离效果较好。色谱图见图1。

图1 原阿片碱对照品(A)和夏天无滴眼液(B)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of protopine standard sample(A) and rhizoma corydalis decumbentis eye drops (B)

2.2.2 线性关系考察结果：原阿片碱峰面积(A)与浓度(C)进行回归分析，得到线性方程：A=28.2207C-36.1446(r=0.9999，n=9)。结果表明原阿片碱浓度在14.2～142 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度试验结果：低、中、高浓度的原阿片碱对照品溶液日内精密度及日间精密度考察结果见表1。

表1 精密度试验结果

2.2.4 加样回收率试验结果：回收率试验结果见表2。

表2 加样回收率试验

2.2.5 耐用性试验结果：当流动相比例、柱温、流速发生细微变化时，对测定结果影响较小，主吸收峰与其它吸收峰均能够达到基线分离，表明本方法耐用性较好。

2.2.6 样品含量测定结果：样品中原阿片碱的含量见表3。

表3 样品含量测定结果

2.2.7 稳定性试验结果：原阿片碱供试品0、2、4、8、10、12、24 h进样，其峰面积的RSD为0.55%，结果表明样品溶液在24 h内稳定。

3 讨论

流动相选择上本研究尝试使用了以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%三氟乙酸和甲醇-0.1%三氟乙酸作为流动相系统，结果显示使用乙腈-0.1%三氟乙酸作为流动相，色谱峰形、对称性好，无需加入缓冲液，且三氟乙酸较三乙胺粘度低，可以较方便地从制备样品中除去。原阿片碱的保留时间是6.2 min，与文献[12]报道的原阿片碱保留时间12.6 min相比，可以缩短原阿片碱的保留时间，提高了分析的效率。

本研究建立了高效液相色谱测定夏天无滴眼液中原阿片碱含量的方法，采用样品稀释后直接进样，流动相不需用三乙胺调节，更为简化。在不影响分离效果的情况下原阿片碱出峰时间缩短,提高了工作效率，方法简便快速，结果准确可靠，重现性好，为该药品质量控制提供依据。

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[6]顾孝红，唐平，靳祖英.反相高效液相色谱法测定夏天无中原阿片碱的含量[J].时珍国医国药，2002，13(10)：608-609.

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(编校：王俨俨)

Determination of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops by HPLC

CAI Yong-hao, XU Xue-gu, LIN Pei-zhen, YU Yin-feiΔ

(Department of Pharmacy,The Affiliated Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of content of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops.MethodsThe HPLC separation was carried out on a ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)column，the mobile phase was acetonitrile-0.1%TFA solution(25:75) with the velocity of 1 mL/min and the column temperature of 30 ℃，the detection wavelength was set at 290 nm.And the injection volume was 20 μL.ResultsThe good linearity of protopine under chromatography was found of 14.2-142 μg/mL (r=0.9999,n=9),The average recovery rate was 104.5% with RSD of 2.47%,Both intra- and inter-day precision RSD were less than 1%(n=5).The samples were stable in 24 h.ConclusionThe method is simple,accurate and repeatable,it can be used for the quality control of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops.

rhizoma corydalis decumbentis eye drops; protopine; HPLC; content determination

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.58

温州市公益性科技计划(Y20150372)

蔡永豪，男，本科，主管药师，研究方向：眼用药物制剂研究，E-mail：cyh@mail.eye.ac.cn；郁引飞，通信作者，男，本科，主任药师，研究方向：眼用药物制剂研究，E-mail：wz88068866@163.com。

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