钱飚，鲁宏峰，孙龙

(宁波市第二医院 乳腺外科，浙江 宁波 315000)

Ki-67的改变与Ⅱ-Ⅲ期浸润性乳腺癌患者化疗疗效之间的关系

钱飚Δ，鲁宏峰，孙龙

(宁波市第二医院 乳腺外科，浙江 宁波 315000)

目的 探讨增殖细胞核抗原(Ki-67)与Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌患者新辅助化疗疗效的关系。方法 选取宁波市第二医院乳腺外科收治的89例初治Ⅱ-Ⅲ期浸润性乳腺癌患者作为研究对象，新辅助化疗前通过穿刺取癌组织进行免疫组化染色，3 w新辅助化疗完成后进行乳腺癌根治性手术治疗，取手术后癌组织行免疫组化染色，对比不同Ki-67的表达水平与患者化疗近期效果的关系，并分析化疗效果与患者的临床病理特征的关系。结果 化疗前，Ki-67高表达患者52例，低表达37例，高表达患者的缓解率63.46%显著的高于低表达组患者的35.13%(P<0.05)；化疗后Ki-67的高表达率38.20%显著低于化疗前的58.43%(P<0.05)；采用Logistic模型分析，结果显示淋巴结转移、临床分期Ⅲ期、MP分级3+4级、Ki-67低表达降低缓解率(P<0.05)。结论 Ki-67与Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌患者新辅助化疗疗效关系密切，可以作为临床上术前辅助化疗效果评估的参考指标。

Ki-67；浸润性乳腺癌；新辅助化疗

乳腺癌(breast carcinoma)是临床常见的恶性肿瘤类型，绝大多数患者为女性，其发病高峰年龄为45～55岁，以围绝经期女性较多见。尽管随着环境的恶化和生活方式的改变，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，但其死亡率却较之前有所下降，这一现状得益于近年来临床对乳腺癌诊疗过程的规范化和治疗水平的提高[1]。在接受根治性手术治疗联合化疗后，多数乳腺癌患者可获得良好的预后。

Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌已属于中晚期，此时行根治性手术治疗的效果略差，手术难度较大。新辅助化疗是乳腺癌治疗的重要组成部分，Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌术前接受新辅助化疗有助于手术的顺利实施，其治疗效果已得到临床公认[2]。随着对乳腺癌研究的不断深入，对肿瘤生物学标志物的研究已成为近年来临床研究的热点。Ki67是一种核抗原，与细胞增殖密切相关，是目前临床用于评价肿瘤细胞增殖能力的常用标志物[3]。研究探讨了Ki-67与Ⅱ-Ⅲ期浸润性乳腺癌患者新辅助化疗疗效的关系，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取宁波市第二医院乳腺外科收治的89例初治Ⅱ-Ⅲ期浸润性乳腺癌患者作为研究对象，年龄34～65岁，平均年龄(47.6±9.8)岁，临床分期：Ⅱ期45例、Ⅲ期44例，组织学分型：浸润性导管癌84例、浸润性小叶癌5例，绝经34例，雌激素受体阳性35例，淋巴结转移27例，病理组织学(Miler Payne, MP)分级：1级21例、2级23例、3级28例、4级17例。

纳入标准：入选病例化疗前穿刺取活组织检查诊断为浸润性乳腺癌，临床分期Ⅱ～Ⅲ期；患者可进行手术治疗和辅助性化疗；入组时经过彩超、CT、MRI等检查证实未发生远处转移；与患者签订知情同意书。

排除标准：合并严重的肝肾功能障碍，不适宜进行新辅助化疗的患者；具有手术禁忌症的患者；非初治的患者。

1.2 方法

1.2.1 新辅助化疗方法:新辅助化疗为TEC方案：静脉注射多西他赛(T)(国药准字H20064301，江苏奥赛康药业股份有限公司)剂量为75 mg/m2，第1、5天；盐酸多柔比星(EPI)(国药准字H20041318，浙江海正药业股份有限公司)剂量为70 mg/m2，第1～3天；环磷酰胺(CTX)(国药准字H14023686，山西普德药业股份有限公司)剂量为600 mg/m2，第1～3天。每21 d为1个化疗周期。

1.2.2 乳腺癌根治手术方法：行静吸复合全身麻醉，采用环形切口，将病变乳腺连同肿瘤周围5cm宽的皮肤、周围脂肪组织、胸大肌、胸小肌、筋膜组织、腋窝、锁骨下淋巴结等全部切除。

1.2.3 免疫组化法：标本均经10%福尔马林固定，用PBS代替一抗作为空白对照，定性切片作为阳性对照。冲洗、脱水，脱水操作依次为80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇2次、无水乙醇2次。二甲苯透明2次。浸蜡、包埋后进行塑型、切片。展片后使切片贴附于载玻片，干燥。将切片置于60 ℃温箱中烤片1 h，放于二甲苯脱蜡10 min，无水乙醇洗去二甲苯。依次采用95%、90%、80%、70%、50%乙醇、蒸馏水洗涤。

将1 500 mL已稀释成工作液的柠檬酸盐缓冲液放于压力锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温染色架进行高温高压组织抗原修复。流水冲至压力锅冷却，取出耐高温染色架自然冷却后采用蒸馏水、PBS冲洗。采用甩法除去PBS，5%正常羊血清封闭液室温下孵育30 min。湿盒中除去5%正常羊血清封闭液，滴加1:100稀释的第一抗体，4 ℃冰箱过夜，室温中放置20 min，PBS冲洗3次。除去PBS液，切片滴加适量即用型二抗，室温下孵育20 min。PBS冲洗3次，除去PBS液，切片滴加适量链霉素，室温下孵育30 min。PBS冲洗3次，除去PBS液，切片上滴加1滴新鲜配制的DAB显色试剂，室温下显色3～5 min。

切片放入蒸馏水中以中止显色，自来水流水冲洗，苏木素浅染。0.2%盐酸酒精分化，在40 ℃温水中返蓝。从低浓度到高浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明2次。滴加少量树胶，盖玻片固封。进行常规病理观察。所用一抗、二抗均购自广州市凯秀贸易有限公司。

1.2.4 免疫组化结果及化疗效果评价:参照实体瘤的疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)实体瘤疗效评价标准分为：完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)，缓解率=(CR+PR)/本组样本量×100%。

免疫组化结果判定：Ki-67阳性着色定位于细胞核，呈黄色、棕色、褐色，在400倍显微镜下进行观察，计数每1 000个细胞中阳性细胞所占比例，阳性指数(PI)=(阳性细胞数/1 000)×100%，阳性细胞比例≥14%定义为高表达，<14%为低表达。

1.3 统计学方法 数据在SAS9.3软件包中处理，计数资料采用%表示，组间比较采用χ2检验；多因素分析分析采用Logistic回归模型；P<0.05表示差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 不同Ki-67表达与疗效的关系 化疗前，Ki-67高表达患者52例，低表达37例，高表达患者的缓解率63.46%显著的高于低表达组患者的35.13%，差异有统计学意义(χ2=6.946，P<0.05)。见表1。

表1 不同Ki-67表达与疗效的关系

2.2 化疗前后Ki-67表达的变化 化疗前，Ki-67高表达患者52例，低表达37例，化疗后高表达34例、低表达54例，化疗后Ki-67的高表达率38.20%显著低于化疗前的58.43%，差异有统计学意义(χ2=7.289，P<0.05)。见表2，图1。

表2 化疗前后Ki-67表达的变化[n(%)]

图1 Ki-67在乳腺癌组织中的表达(SP×400)Fig.1 Expression of Ki-67 in breast cancer (SP×400)

2.3 化疗效果与患者的临床病理特征关系分析 Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌患者术前新辅助化疗缓解率与患者是否发生淋巴结转移、临床分期、MP组织学分级具有相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 化疗效果与患者的临床病理特征关系分析[n(%)]

2.4 化疗效果与患者的临床病理特征关系的多因素分析 将患者化疗结果是否缓解作为因变量，2.2中单因素具有统计学意义的因素和Ki-67表达情况作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示：淋巴结转移、临床分期Ⅲ期、MP分级3+4级、Ki-67低表达降低缓解率。见表4。

表4 化疗效果与患者的临床病理特征关系的多因素分析[n(%)]

3 讨论

乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，99%的患者为女性。由于乳腺组织并不是维持人体生命活动的重要器官，因此原位乳腺癌并不致命。但癌细胞一旦发生脱落，可随血液或淋巴液播散至全身，在重要器官形成转移后而危及患者生命。早期乳腺癌并不具备典型的症状和体征，一般通过体检或乳腺癌筛查发现。早期发现、早期诊断、早期手术是改善患者预后的关键[4]。当乳腺癌进展至Ⅱ～Ⅲ期往往已经错过了最佳的手术时机。但近年来随着对恶性肿瘤认识程度的深化，发现新辅助化疗(又称术前化疗)在缓解肿瘤病情的进展、争取手术机会方面具有重要的作用[5]。对恶性肿瘤的治疗手段采用全身与局部治疗相结合的综合治疗效果明显优于单一的局部治疗。在对乳腺癌的治疗中，也从单纯的乳腺癌根治性手术转变为手术与化疗、放疗、内分泌治疗等全身治疗相结合[6]。其中化疗占据乳腺癌治疗的重要地位，对手术效果也产生一定的影响[7]。

乳腺癌新辅助化疗的概念在20世纪70年代首次提出，对不可手术的局部进展期乳腺癌进行诱导化疗，使患者满足手术要求[8]。乳腺癌的新辅助化疗不仅有助于消灭全身微小转移灶、降低癌症分期，还可缩小手术范围，增加保乳手术机会，进而改善患者的预后[9]。有研究发现，部分乳腺癌患者在接受新辅助化疗后获得病理完全缓解，无瘤生存期和总生存期均得以延长[10]。

病理组织学检查是判断肿瘤临床分期的手段，但标本的取得需要进行穿刺或手术，属于有创性操作。病理组织学检查操作繁琐，其结果的得出往往具有一定的滞后性。因此寻找一种肿瘤生物学指标对评估肿瘤分期具有重要的现实意义。Ki67是一种增殖细胞核抗原，与细胞的有丝分裂周期密切相关。Ki67仅在增殖细胞的细胞核内发生反应，在DNA合成中发挥着重要作用[11]。有研究发现，Ki67与恶性肿瘤的发生、浸润、转移等过程相关，但其确切的生物学功能目前尚未确定。Ki67在不同的细胞周期表达不同，G0期、G1早期不被标记，G1后期开始表达，S 期、G2期表达增加，M期达到高峰状态[12]。由于Ki67表达具有时间特异性，可将其作为细胞增殖状态的标记物，直观反映增殖细胞的数量，用以评估肿瘤细胞的增殖能力非常适合。将Ki67和临床疗效的表现相结合，有助于从细胞学水平反映肿瘤细胞的增殖状态，对判断肿瘤恶性程度、化疗效果、预后具有深远的意义。

研究根据化疗前患者Ki-67表达水平将患者分成高表达组和低表达组，高表达患者多于低表达患者，其中高表达患者的缓解率显著高于低表达组(P<0.05)，这一结果提示，Ⅱ～Ⅲ期浸润性乳腺癌患者多数为Ki-67高表达，高表达患者化疗效果比低表达患者差。化疗后Ki-67的高表达率显著低于化疗前(P<0.05)。这一结果提示，化疗后，患者的Ki-67表达水平下降。采用Logistic模型分析，发现淋巴结转移、临床分期Ⅲ期、MP组织学分级(3～4级)、Ki-67低表达降低缓解率(P<0.05)，因此在今后的临床工作中可将Ki67表达水平作为判断临床分期、组织学分级、化疗效果的生物学指标。

研究结果表明：Ki-67与Ⅱ-Ⅲ期浸润性乳腺癌患者新辅助化疗疗效关系密切，可以作为临床上术前辅助化疗效果评估的参考指标。

[1] 黄哲宙，陈万青，吴春晓，等.中国女性乳腺癌的发病和死亡现况——全国32个肿瘤登记点2003～2007年资料分析报告[J].肿瘤，2012，32(6)：435-439.

[2]Choi BB, Shu KS.Metaplastic carcinoma of the breast:Multimodality imaging and histopathologic assessment[J].Acta Radiologica, 2012, 53(1):5-11.

[3]王宝娜，王翔，王靖，等.Ki67在乳腺癌中的表达及临床意义[J].中华肿瘤杂志，2014，36(4)：273-275.

[4]赵军.钼靶X射线、超声及MRI对乳腺癌诊断的应用价值[J].现代仪器与医疗，2014，4(4)：26-28，43.

[5]徐强音，陈翔，陈燕玉，等.新辅助化疗联合保乳术治疗Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌的疗效[J].广东医学，2013，34(4)：611-613.

[6]刘钊，尉承泽，黄焰，等.乳腺癌新辅助化疗疗效与临床特征的相关性研究[J].军事医学，2013，37(9)：700-703.

[7]曾峰，谭永嘉，曾庆良，等.TE方案新辅助化疗在乳腺癌治疗中的应用观察及机制探讨[J].山东医药，2012，52(2)：62-63.

[8]Adamkov M, Vybohová D, Horádek J, et al.Survivin expression in breast lobular carcinoma:Correlations with normal breast tissue and clinicomorphological parameters[J].Acta Histochem, 2013, 115(5):412-417.

[9]邓伟雄，汤勇才，张年伟，等.乳腺癌患者血清血管内皮生长因子水平与临床病理特征及新辅助化疗疗效的相关性[J].实用医学杂志，2015，4(18)：2963-2965.

[10]王妍，贾羽峰，井明晰，等.新辅助化疗对乳腺癌的疗效及影响因素分析[J].中国医药导报，2013，10(11)：45-47.

[11]朱丽萍，王斌，李涌涛，等.乳腺癌易感基因1、Ki-67在青年乳腺癌患者组织中的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志，2012，29(5)：830-832.

[12]魏昕，杨举伦.Ki-67和PCNA表达与乳腺癌及乳腺癌化疗敏感性的关系[J].中国免疫学杂志，2014，2(11)：1549-1551.

(编校：王俨俨)

Relationship between Ki-67 and the chemotherapy effect of phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer

QIAN BiaoΔ, LU Hong-feng, SUN Long

(Department of Breast Surgery, Second Hospital of Ningbo, Ningbo 315000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between Ki-67 and the chemotherapy effect of phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer.Methods89 cases phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer patients enrolled into our hospital were collected through biopsy and immunohistochemically stained.After 3 weeks’ neoadjuvant chemotherapy, cancer tissue were taken by surgery.The expression of Ki-67 before and after chemotherapy were compared.ResultsBefore chemotherapy, 52 patients with Ki-67 high expression had 63.64% response rate, which were higher than 35.13% in 37 cases with Ki-67 low expression (P<0.05).After chemotherapy, high Ki-67 expression decreased from 58.43% to 38.20% (P<0.05).Logistic model analysis showed:lymphatic metastasis, phase Ⅲ, MP histological grade (grade 3-4) would decrease the remission rate (P<0.05).ConclusionKi-67 is closely related with the chemotherapy effect of phraseⅡ-Ⅲ invasive breast cancer, which can be a clinical reference for preoperative adjuvant chemotherapy.

Ki-67; invasive breast cancer; neoadjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.56

钱飚，通信作者，男，本科，副主任医师，研究方向：肿瘤、乳腺，E-mail：moneybiao@yeah.net。

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