孔 杰，蒋晓红，周 洲，张竹青，周 路，李道友

（贵州省水产研究所，贵州贵阳550025）

磁珠富集法开发长臀鮠微卫星分子标记

孔 杰，蒋晓红＊，周 洲，张竹青，周 路，李道友

（贵州省水产研究所，贵州贵阳550025）

为长臀鮠遗传育种、种质鉴定和种苗流放等提供理论依据，采用磁珠富集法开发长臀鮠（Cranoglanis bouderius）微卫星分子标记，筛选获得阳性克隆进行分析，选取侧翼较长的序列，用Primer Premier 5.0设计合成引物。结果表明：从596个白斑中筛选获得80个阳性克隆，测序获得微卫星序列47个，其中完美型31个（66%），非完美型14个（30%），复合型2个（4%）。设计合成32对引物，通过优化反应条件，得到27对引物能扩增特异条带，其中多态性引物24对。

磁珠富集；长臀鮠；微卫星标记

长臀鮠（Cranoglanis bouderius），俗称牛毛鱼、牯鱼，隶属鲇形目（Siluriformes）、长臀鮠科（Cranoglanididae）、长臀鮠属（Cranoglanis），是珠江水系特有的名贵经济鱼类，在《中国濒危保护动物红皮书》中被列为易危鱼类［1］。其分布于中国南部珠江水系，海南岛，云南的元江水系，贵州省南、北盘江和红水河流域以及越南的红河水系。长臀鮠肉质鲜美、营养丰富，含有人体所需的7种必需氨基酸和10种非必需氨基酸，不饱和脂防酸含量高，深受大众欢迎，具有较高的经济价值［2］。目前，对长臀鮠的研究主要集中在生理、营养和生物学特性方面，关于遗传多样性的报道甚少，且多为采用线粒体基因组［3］和AFLP分析的方法［4］。微卫星是种群遗传结构分析、种群遗传多样性鉴定、遗传图谱的构建及生产性状位点的连锁分析中最理想的分子标记之一，应用也最为广泛。采用生物素包被的磁珠富集分离微卫星分子标记是一种简单高效的方法，在水产动物，如鲤鱼［5］和草鱼［6］等的微卫星分子标记开发中都曾被广泛使用，但长臀鮠的微卫星标记的开发目前尚未见报道。笔者使用磁珠富集法筛选长臀鮠微卫星分子标记，以期为此方法在长臀鮠的遗传多样性检测、遗传图谱构建和品系优化等方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验样品

长臀鮠样品采自罗甸龙滩水库，剪取养殖长臀鮠尾鳍约1cm2大小，放于无水乙醇中4℃保存，共采集6尾鱼的鳍条作为样品提取基因组DNA。

1.2 长臀鮠微卫星基因组文库的构建

1.2.1 基因组的提取纯化和酶切 采用上海生工的磁珠法DNA提取试剂盒提取6尾长臀鮠鳍条基因组DNA。用限制性内切酶Bsp143I（Sau3AI）于37℃环境，酶切16h，对基因组进行不完全酶切。1%琼脂糖凝胶电泳检测，切下400～900bp片段，用胶回收试剂盒进行回收与纯化。

1.2.2 接头制备与连接 寡核苷核链A（Brown A），5′GATCGTCGACCGTACCGAATTCT3′；寡核苷核链B（Brown B），5′GTCAAGAATTCGGTA CCGTCGAC 3′。等比例混合Brown A与Brown B，95℃变性10min，然后用4h缓慢降温冷却至10℃，形成带有限制性酶切位点Sau3AI、SalI、EcoRI的双链接头：BrownA，5′GATCGTCGACG GTACCGAATTCT 3′；Brown B，3′CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG 5′。

将双链接头与基因组DNA酶切产物混合，建立连接体系：T4DNA Ligase 1μL（350U），10× buffer 2μL，酶切DNA片段（55ng／μL）6μL，双链接头（25μmol／L）11μL；16℃，连接16h。

1.2.3 长臀鮠基因组PCR文库的构建 以连接双链接头的DNA片段为模板，Brown B为引物，进行PCR扩增，建立50μL反应体系，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后，用PCR产物纯化试剂盒纯化产物。

1.2.4 生物素标记探针与基因组的杂交 配制杂交液：生物素探针Biotin－（CA）151.5μL，Brown B 2.5μL，20×SCC 15μL，10%SDS 0.5μL，ddH2O 30.5μL。68℃预热杂交液，快速加入15μL基因组片段，95℃变性5min，杂交1h。

1.2.5 磁珠富集法分离微卫星序列

1）磁珠的平衡。将磁珠摇匀，吸取100μL至硅化离心管中，放在磁力架（MPC）上1～2min，吸出盐溶液；加入200μL B＆W洗液，洗2～3次；加入200μL洗液Ⅰ（6×SSC，0.1%SDS）反复洗涤6～8次，直到磁珠外观变得顺滑易脱。加入200μL洗液Ⅰ，室温放置。

2）磁珠的吸附富集。将杂交液加入已平衡好的磁珠中，置于25℃水浴锅中温育1.5h，并轻轻摇动；将离心管放置在磁力架上1～2min，去除溶液。分别用200μL洗液Ⅰ，室温下洗2次，每次静置10min；200μL洗液Ⅱ（3×SSC，0.1%SDS），68℃洗2次，每次静置15min；200μL洗液Ⅲ（6× SSC），室温下快速洗2次；200μL 0.1×TE，室温，快速洗2次；加入30μL 0.1×TE，95℃变性10min，冰浴10min，释放出含有微卫星序列的单链DNA。

1.2.6 长臀鮠微卫星文库的构建 以含微卫星序列的单链DNA为模板，Brown B为引物，建立50μL反应体系，进行PCR扩增，方法同第1次PCR扩增。反应结束后，用PCR产物纯化试剂盒（上海生工）纯化产物。电泳检测。

将富集扩增的产物与pMD18－T（TAKARA公司）载体相连，转化入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中（TAKARA公司），建立长臀鮠的微卫星富集文库。蓝白斑筛选获得阳性克隆，进一步采用PCR检测鉴定阳性克隆，以单克隆菌斑为DNA模板，Brown B为引物，进行PCR扩增，电泳检测，所得阳性克隆送至上海生工以及北京诺赛公司进行测序。

1.3 微卫星序列分析、引物设计与合成

测序结果通过软件SSRHunter探查，记录位点的重复情况，根据微卫星两端的保守序列，去除因为缺乏足够的侧翼序列或者本身结构原因而无法设计引物的序列，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，并将序列送至上海生工合成。

2 结果与分析

2.1 菌落PCR鉴定阳性克隆

经初次筛选后构建长臀鮠微卫星文库，共获得约3 000个克隆，其中重组克隆约2 100个。随机挑选白斑596个，通过PCR鉴定出阳性克隆80个，部份电泳情况见图1。阳性克隆率（PCR鉴定阳性克隆个数／重组克隆个数）为13.4%。将80个阳性克隆进行测序，获得含有重复次数＞5次的微卫星序列克隆45个，微卫星富集效率［7］（测序含有微卫星序列克隆数／PCR鉴定阳性克隆个数）为56.3%。

2.2 微卫星引物的设计与扩增情况

经检测共获得微卫星位点47个（重复次数≥5次）。按照重复序列碱基数目划分：2碱基重复序列44条，约占94%，除（CA／GT）n重复外，还获得（CT）n重复；3碱基重复序列1条，约占2%；4碱基重复序列2条，约占4%。按照Weber提出的测序标准对获得的微卫星标记进行归类：完美型31个，约占66%；非完美型14个，约占30%，复合型2个，约占4%。

在47个微卫星位点中，设计合成微卫星引物32对。通过优化PCR反应条件，摸索适合的退火温度（图2），选择扩增无杂带且特异性高的退火温度，得到27对引物。用12尾长臀鮠为样本进行分析，其中24对具有多态性，其详细信息见表。由图3可见，引物Cb28在其中6个个体中扩增等位基因7个，表明引物具有多态性。

图1 PCR鉴定阳性克隆的部份电泳图谱Fig.1 Part of electrophoresis of positive clones identified by PCR

图2 不同退火温度下微卫星引物Cb28和Cb30在长臀鮠中扩增的电泳图谱Fig.2 Electrophoresis map of microsatellites Cb28and Cb30in C.bouderius at different annealing temperature

图3 多态性引物Cb28在部份个体中的等位基因峰Fig.3 The electropherogram peaks of polymorphic microsatellite primer Cb28in some individuals

表 长臀鮠微卫星分子标记及其引物Table Microsatellite markers and their primers in C.bouderius

3 结论与讨论

获得微卫星方法通常有3种：一是从近缘物种中获得；二是从网上公布序列中获得；三是直接克隆，包括随机克隆法和磁珠富集法［8］。自1994年Kandpal R等［9］提出磁珠富集法筛选SSR引物后，此方法在水产动物上应用十分广泛，如草鱼［6］、银鲫［10］、扇贝［11］、大口鲶［12］及施氏鲟［13］等应用此法获得微卫星序列的报道。长臀鮠一直是通过近缘物种获取微卫星标记，标记数量不足，使得长臀鮠分子标记辅助育种受到限制，笔者将此法应用到长臀鮠的开发中，获得27条在长臀鮠中特异扩增的微卫星引物，其中多态性引物24对，丰富长臀鮠的微卫星标记数量。

试验阳性克隆率为13.4%，这是多次试验的平均值。由于前几次使用的连接产物放置时间过久，导致阳性克隆率低，在最后一次试验中，重新构建连接产物进行转化，通过PCR检测阳性克隆率达46.8%，曹柱［7］等筛选方正银鲫微卫星标记阳性克隆率为13.76%，于冬梅［13］筛选史氏鲟微卫星标记筛选为21.4%，全迎春［12］等筛选大口鲶微卫星标记为42.36%。该阳性克隆率优于同类试验结果。

从近缘物种的微卫星序列开发适用标记，属间的微卫星适用性较高，若跨科物种的微卫星适用性较低，如卜兴江［14］等利用21个中华鳖微卫星对8个物种进行跨物种检验结果显示，中华鳖的21个微卫星位点在同为鳖科的5个种获得可适用引物15～20对，平均获得率约为85%，而在另外2个不同科3个物种获得可适用引物6～13对，平均获得率约为46%。目前并无长臀鮠科属的鱼类开发微卫星标记的报道，而在跨科物种间的微卫星开发得率较低，若从同目的其他鱼类中筛选长臀鮠适用性微卫星标记可能会更困难。笔者采用磁珠富集法构建长臀鮠的微卫星文库，获得27对长臀鮠微卫星引物，其中多态性引物24对，引物扩增效果好，可用于长臀鮠及其近缘物种的种群遗传学及多样性分析、连锁图谱构建及亲缘关系鉴定等方面研究，为长臀鮠分子标记育种及增殖放流等提供基础依据。

［1］刘采霞，彭作刚，何舜平.长臀鮠属鱼类多变量形态分布及物种有效性研究［J］.水生生物学报，2005，29 （5）：507－512.

［2］谢少林，陈金涛，王 超，等.珠江水系不同地理居群长臀鮠肉质品质的对比分析［J］.淡水渔业，2014，44 （1）：20－24.

［3］高志远，章 群，夏月恒，等.松涛水库长臀鮠遗传多样性研究［J］.广东农业科学，2013（3）：98－105.

［4］程 飞，谢松光，叶 卫，等.长臀鮠的AFLP分析［J］.水生生物学报，2009，33（3）：539－544.

［5］巍东旺，楼允东，孙效文，等.鲤鱼微卫星分子标记的筛选［J］.动物学研究，2001，22（3）：238－241.

［6］孙效文，鲁翠云，梁利群.磁珠富集法分离草鱼微卫星标记［J］.水产学报，2005，29（4）：482－486.

［7］曹 柱，鲁翠云，郑先虎，等.磁珠富集法筛选方正银鲫的三、四核苷酸重复微卫星DNA［J］.淡水渔业，2011，41（1）：22－28.

［8］孙效文，张晓锋，赵莹莹，等.水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用［J］.中国水产科学，2008（15）：689－703.

［9］Kandpal R，Kandpal G，Weissman S.Construction of libraries enriched for sequence repeats and jumping clones，and hybridization selection for region－specific markers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：88－92.

［10］姬长虹，孙效文.用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记［J］.大连水产学院学报，2007，22（6）：410－464.

［11］赵莹莹，朱晓琛，孙效文，等.磁珠富集法筛选虾夷扇贝微卫星序列［J］.中国水产科学，2006，13（5）：740－754.

［12］全迎春，孙效文，刘 伟，等.磁珠富制备大口鲶的微卫星分子标记［J］.水产学报，2006，30（2）：185－191.

［13］于冬梅，匡友谊，马海涛，等.用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记［J］.大连水产学院学报，2007，22（6）：431－435.

［14］卜兴江，聂刘旺.中华鳖多态性微卫星标记跨物种扩增研究［J］.生物学杂志，2013，30（1）：27－30.

（责任编辑：刘忠丽）

Development of Microsatellite in Cranoglanis bouderius by Magnetic Beads

KONG Jie，JIANG Xiaohong＊，ZHOU Zhou，ZHANG Zhuqing，ZHOU Lu，LI Daoyou

（Aquaculture Science Institute of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou550025，China）

To provide the theoretical basis for genetic breeding，germplasm identification and releasing.Magnetic beads enriched method was used to isolate microsatellites fromC.bouderius，through sequencing and analysis the positive colonies，the repeats which contained enough flanking region were obtained to design 32microsatellite primers by the software Primer Premier 5.0.Results：80positive colonies were obtained through 596white spots.Sequencing of the 80positive colonies confirmed that 47 microsatellite sequences were obtained.From these sequences，31sequences（66%）were perfect repeats，14（30%）were imperfect repeats，and two sequences（4%）were compound repeats.27pairs of microsatellite primers used successfully to amplify special fragments at appropriate annealing temperature，and 24pairs of them were polymorphism within species.

enrichment by magnetic beads；Cranoglanis bouderius；microsatellite marker

S965.299

A

1001－3601（2016）07－0287－0014－04

2016－04－12；2016－07－02修回

贵州省科技计划课题项目“长臀鮠生长相关微卫星标记的筛选及其应用潜力研究”［黔科合NY字（2012）3053］

孔 杰（1986－），女，助理研究员，硕士，从事水产生物技术与鱼类分子鉴定研究。E－mail：kellykj＠126.com

＊通讯作者：蒋晓红（1968－），女，副研究员，从事水产养殖研究。E－mail：243475908＠qq.com