刘 慧，赵依诗，吴 晨，张少斌＊

（1.沈阳农业大学土地与环境学院辽宁沈阳110866；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866）

粮用豌豆组织培养及植株再生条件优化

刘 慧1，赵依诗2，吴 晨2，张少斌2＊

（1.沈阳农业大学土地与环境学院辽宁沈阳110866；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866）

为了豌豆遗传转化及优良品种快速繁殖提供借鉴，进行了豌豆组织培养及植株再生条件试验。结果表明：豌豆的叶柄是诱导愈伤组织的最佳材料，在MS培养基中添加2，4－D（1mg／L）和BA（0.5mg／L），愈伤诱导率达100%，但愈伤组织在分化培养基中未能分化出芽；豌豆子叶节是芽分化的最佳材料，在分化培养基上可分化出丛生芽，不同激素条件下萌发率均达100%。在MS＋ZT（1mg／L）条件下，丛生芽最长；而在MS＋BA（10mg／L）条件下，丛生芽最多。豌豆子叶节丛生芽在MS＋IBA （0.5mg／L）培养基上生根率最高，达40%以上，试管苗的移栽成活率为90%以上。

豌豆；组织培养；植株再生

豌豆是一种重要的经济作物，种子不仅可以粮用饲用［1］，而且豌豆嫩粒、嫰荚以及嫩苗等还可以作为蔬菜食用［2］。同时，由于豌豆根部共生有固氮根瘤菌，对于养地倒茬具有重要意义［3］。豌豆蛋白质含量高［4］，富含膳食纤维、胡萝卜素和微量元素等，具有较高的营养保健价值［5］。同时，豌豆还具有激活免疫系统及防治肿瘤等作用［6］。我国豌豆栽培历史悠久，目前豌豆总产量居世界第2位［7］，但豌豆单产不高，经济效益较低，主要在云南、青海和甘肃等干旱、半干旱地区种植［8］，用于作物轮作倒茬，改良土壤［9－10］。随着对豌豆制品的需求日益增长［11］，有必要利用现代生物技术开展豌豆的遗传育种等研究工作，提高豌豆的品质及其产量［12］。目前，关于豌豆组织培养以及遗传转化的研究较为滞后，因此，进行粮用豌豆组织培养与植株再生技术试验，为其遗传转化及优良品种快速繁殖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

粮用豌豆由沈阳农业大学生物化学实验室保存。

1.2 无菌苗获得

挑选色泽鲜亮、粒大、饱满、种皮无破损及无霉病斑的豌豆种子，先用自来水冲洗4～5次，在超净台上用75%的酒精浸泡1min，转入0.1%HgCl2溶液中浸泡10min，无菌水漂洗4～5次，接种于MS培养基中培养5～7d左右。

1.3 愈伤组织诱导

将一部分无菌苗保留叶柄部分，沿子叶纵向切开，分别放入愈伤培养基［13］MS＋2，4－D（1mg／L）＋BA（0.5mg／L）、MS＋BA（1mg／L）、MS＋2，4－D （1mg／L）＋NAA（0.5mg／L）中进行愈伤组织诱导，统计出愈率并筛选出最佳的诱导愈伤组织培养基。

1.4 愈伤组织分化

将成功诱导出的愈伤组织放入附加不同激素浓度的BA和ZT培养基中，统计分化率、芽长等指标。

1.5 芽分化

将无菌苗的两片子叶从子叶节处切开，保留3～4mm下胚轴，切去已经萌发的顶芽及侧芽，分别放入芽分化培养基MS＋ZT（1mg／L）、MS＋BA （2mg／L）＋IBA（0.2mg／L）和MS＋BA（10mg／L）进行丛生芽的诱导，统计分化率、芽长等指标。

1.6 根诱导

将丛生芽切下，分别放入生根培养基MS＋IBA （0.5～2mg／L）中进行根的诱导，统计生根情况。

以上各项试验处理都为3次重复，培养基中附加3%蔗糖和0.7%琼脂，pH 5.8，在室温（25±1）℃，光照为40W日光灯每天光照14h培养，每10d观察并记录生长情况。

2 结果与分析

2.1 豌豆叶柄愈伤组织的形成及芽分化

从表1看出，MS＋BA（0.5mg／L）＋2，4－D （1mg／L）和MS＋2，4－D（1mg／L）＋NAA （0.5mg／L）的培养条件下均可诱导出愈伤组织，且诱导率均较高，但形成愈伤组织的形态不一样，前者愈伤组织呈淡黄色，质地较紧实，是理想的愈伤组织材料。但附加不同激素浓度的BA，ZT各处理中均未分化出芽。上述结果与其他已报道的研究结果相似［14］。

2.2 豌豆子叶节的丛生芽萌发与生长情况

从表2看出，直接把子叶节接种于各处理中，丛生芽产生率为100%，但平均芽长、生长情况呈一定差异。当培养基中只加ZT（1mg／L）时，丛生芽通常为1～2个，多为2个，较粗，较长，叶片呈张开状，说明在此浓度下，有利于培养壮芽。当培养基加有BA（2mg／L）和IBA（0.2mg／L）时，丛生芽通常为3～4个，多为4个，较细，较短，叶片呈闭合状，说明在此浓度下，有利于得到更多的丛生芽。当培养基中只加有BA（10mg／L）时，由于激素浓度过高，虽然所得丛生芽数较多，但较细，较短，且颜色呈深绿色，无很强的生命力。因此，应根据不同的需要选择不同类型的培养基。

表2 不同激素组合子叶节的丛生芽萌发及生长情况Table 2 Germination and growth of buds clustered on pea cotyledon node treated with different hormone combination

2.3 丛生芽根的诱导

分化的丛生芽生长到3～5cm时，分别接种于IBA（0.5～2mg／L）不同浓度的MS培养基中，10d左右在芽基部开始膨大（图示－1），15d左右可明显观察到在膨大的组织块上有根出现，且逐渐伸长，25d左右根的长度达3cm以上（图示－2）。从表3看出，根的诱导与IBA浓度有关，随着IBA浓度的升高，根的诱导率反而下降，IBA为0.5mg／L时，诱导率可达43%。

图示 豌豆子叶节丛生芽的生根诱导Fig. Rooting of adventitious buds on pea cotyledon node

表3 IBA对豌豆子叶节丛生芽根的诱导情况Table 3 Rooting of adventitious buds on pea cotyledon node treated with IBA

2.4 试管苗移栽

当试管苗的主根伸长约2cm，且长出2～3条须根时，揭开封口膜在室温下炼苗7d后，将其根部的培养基用自来水冲洗干净，移栽于营养土中，浇足水分，保持湿度，成活率可达90%以上。

3 结论与讨论

1）在组织培养中，选择适合的外植体是组织培养能否成功的关键［15－16］。试验中，豌豆的叶柄是最佳形成愈伤组织的材料。但在随后的诱导愈伤分化的试验中，附加不同激素浓度的BA，ZT处理中并未成功，从该愈伤组织中诱导芽有待进一步研究。苏承刚［2］等研究表明，食荚型豌豆的茎段诱导愈伤组织比率较高，但同样也没有诱导芽的产生。由此可见，豌豆叶柄愈伤组织难以诱导产生再生植株，不是遗传转化的理想材料。

2）将豌豆的子叶节接种于附加激素BA、ZT和IBA不同组合的分化培养基中，3d左右直接从节上萌发出多个腋芽，萌发率达100%，腋芽的形态与其附加的激素种类及浓度有关，若浓度太高，不但不会促进丛生芽的生长，反而抑制其进一步分化，因此，应掌握好浓度的选择。丛生芽在MS＋IBA （0.5mg／L）培养基上，生根率超过40%，试管苗的移栽成活率为90%以上。

3）目前已经获得的转基因植物中，80%以上都是通过农杆菌转化获得［17］。而农杆菌侵染的组织细胞往往通过组织培养的方式获得再生植株，如烟草叶盘转化法［18］。在大豆的组织培养中，虽然初生叶，幼胚轴等各种外植体都有成功报道，但子叶节仍然是用于遗传转化的主要材料［19－21］。因此，通过农杆菌侵染豌豆子叶节，而后进行组织培养，还是较为理想的豌豆遗传转化方法。

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（责任编辑：聂克艳）

Condition optimization on Tissue Culture and Plant Regeneration of Pea

LIU Hui1，ZHAO Yishi2，WU Chen2，ZHANG Shaobin2＊

（1.College of Land and Environment，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110866；2.Biological Science and Technology College，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110866，China）

In order to provide references for pea genetic transformation and the rapid propagation of fine varieties，the experiment of tissue culture and plant regeneration of pea was carried out.Results：Pea petiole is the ideal inducing material for callus，2，4－D（1mg／L）and BA（0.5mg／L）were added into MS medium，and the callus induction rate reached 100%，but there were no buds on differentiation medium.Pea cotyledon was the best differentiation material，the germination rate of the cluster buds was up to 100%using different hormones.Under the condition of MS medium with ZT（1mg／L），the cluster buds were the longest，while the number of buds was the most on the MS medium with BA（1mg／L）.The rooting rate of cluster buds was the highest on the MS medium with IBA（0.5mg／L），which could reach more than 40%.The surviving ratio of transplanted plants could exceed 90%.

pea；tissue culture；plant regeneration

S529

A

1001－3601（2016）07－0284－0006－03

2015－11－02；2016－07－01修回

辽宁省自然科学基金“肌动蛋白异型体PEAC3在干旱胁迫中的作用及其响应机制”（2013020072）

刘 慧（1973－），女，实验师，从事植物资源与环境研究。E－mail：187021941＠qq.com

＊通讯作者：张少斌（1973－），男，副教授，博士，从事植物细胞骨架研究。E－mail：zsb010024＠163.com