蒋莉莉，张高原，张建农

(甘肃农业大学 园艺学院，甘肃 兰州 730070)

西瓜杂交组合T-1种子纯度鉴定的SSR标记研究

蒋莉莉，张高原，张建农

(甘肃农业大学 园艺学院，甘肃 兰州 730070)

[摘要]【目的】 研究有效的西瓜杂交组合种子纯度的SSR标记鉴定方法，为室内鉴定的实际应用提供理论依据。【方法】 以西瓜杂交组合T-1及其亲本自交系P-1、M-13为材料，在子叶展平期采用CTAB法提取DNA，利用优化的西瓜SSR标记方法进行杂交种子的纯度鉴定，并与田间表型鉴定进行比较。【结果】 从36对SSR引物中筛选出3对(MCPI-5、MCPI-16、MCPI-17)稳定性强、可重复性好、在杂交种及其母本之间具有多态性的引物。将这3对引物中的MCPI-5和MCPI-16用于267株T-1杂交种群体纯度鉴定，显示种子纯度为97.75%，与田间种植鉴定结果一致。【结论】 3对SSR引物MCPI-5、MCPI-16和MCPI-17可用于西瓜杂交组合T-1种子纯度的室内鉴定。

[关键词]西瓜；杂交种；种子纯度；SSR标记

在种子生产和销售之前，对种子的质量必须严格检测把关，其中种子纯度鉴定为最重要的一项。常规的纯度检测方法为形态鉴定，即田间种植鉴定法，但是其具有耗时耗力、易受环境条件及栽培措施影响等缺点。随着科学技术的进步，种子纯度鉴定技术由传统的田间种植鉴定逐步发展为生化指纹鉴定和分子标记鉴定[1]。西瓜是重要的园艺作物，我国每年种植面积占世界面积的一半以上。而目前生产中推广的品种几乎100%都是杂交一代品种，因此，西瓜杂交种子的室内快速鉴定是简化检测程序、提高检测效果、保证种子纯度的有效技术措施之一。

在田间种植鉴定中，西瓜种子纯度可以根据叶片的形状与大小，如板叶、黄化叶等性状进行初步鉴定，但主要还是依靠果实形状与皮色进行鉴定，因此进行早期鉴定十分困难。同时，由于一些同类品种在果实的外型与颜色上十分接近，单纯依靠表型差异来进行西瓜品种纯度与真实性鉴定也有一定的困难，而DNA分子标记鉴定是解决上述问题的最有效措施[2]。

利用DNA分子标记鉴定种子纯度在多种作物上都有一定研究。刘富中等[3]利用RAPD标记方法从 80个随机引物中筛选出5个可进行3个甜瓜杂交种纯度鉴定的引物；Truksa等[4]在分析了3个黄瓜亲本材料的RAPD 多态性后发现黄瓜多态性差，认为RAPD 分析不适于验证黄瓜杂交种的纯度；张颖等[5]利用SSR 分子标记技术，建立了黄瓜品种室内分子标记遗传纯度鉴定与田间纯度鉴定结果的回归关系；欧阳新星等[6]、王鸣刚等[7]利用RAPD标记对西瓜种子纯度鉴定进行了研究；张红等[8]利用RAPD、SSR标记对甜瓜种子进行纯度鉴定研究，认为SSR标记更适合甜瓜杂交种纯度的快速鉴定。从多方面研究结果来看，RAPD标记可能存在重复性差、易受试验条件、人为因素影响等缺点，因此更加稳定、可靠的标记方法研究，以及针对特定品种(或组合)的技术筛选，有利于该技术在生产实际中的推广应用。

本试验以2个西瓜自交系及杂交F1为试验材料，结合形态学和DNA分子标记2种鉴定方法，建立了一套完整的适合供试西瓜品种的室内种子纯度鉴定体系，以期为其种子纯度的室内快速鉴定奠定基础，并为其他西瓜品种种子纯度的鉴定提供参考。

1材料与方法

1.1材料

供试材料的母本为西瓜自交系P-1(果皮为绿皮(条纹))，父本为西瓜自交系M-13(果皮为花皮(条斑))，还包括由父母本杂交而得到的F1(组合代号T-1，果皮为花皮(条斑))。

1.2方法

1.2.1田间种植鉴定将T-1及其亲本的种子播种于地力、环境条件一致的地块中，高畦覆地膜栽培，田间管理同普通大田，亲本每个样本种植50株，F1种植300株，并进行编号。根据果实皮色鉴别种子纯度。

1.2.2室内SSR分子鉴定(1)DNA的提取及PCR反应程序。采用CTAB法提取西瓜子叶和成熟叶DNA。采用Joobeur等[9]的方法选出36对引物，由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

采用降落PCR反应程序：94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性45 s，59～50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共10个循环，每循环1次温度降1 ℃；94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。特定引物扩增采用的PCR程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，退火45 s(退火温度因引物而定)，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用银染法染色。

(2)引物的筛选及稳定性检测。以T-1及其父、母本DNA为模板，对36对SSR引物进行筛选，寻找在母本和F1中具有多态性的引物，并进行重复试验，以验证引物的稳定性和可靠性。

(3)杂交种子纯度的SSR鉴定及田间鉴定比较。采集田间鉴定过的F1叶片，编号标记，利用上述筛选得到的SSR特异性引物对其进行室内鉴定，并将结果与田间鉴定结果作比较，检测是否与田间鉴定结果相一致。

2结果与分析

2.1田间种植鉴定

根据供试材料杂交组合F1及其亲本的田间表现，确定果实皮色是鉴定F1与母本差异最可靠的性状。当坐果时节雌花开放约1周后，果实长到鸡蛋大小，果实皮色(花纹)即显现出来。由于西瓜果实花皮对绿皮为显性，因此果实表现为花皮，而假杂种则是母本的自交果，表现为绿皮，所以能据此明确地统计出种子纯度。本研究共对正常出苗生长的267株F1进行了统计，其中T-1(杂交一代种子)261株，假杂种6株，种子纯度为97.75%(图1)。

2.2室内SSR分子鉴定

2.2.1引物多态性表现采用36对SSR引物对T-1及其母本叶片DNA进行PCR扩增，从中筛选出在F1与其母本之间具有多态性差异的引物。图3结果显示，36对引物中有5条SSR引物在F1与母本之间可以扩增出多态性差异，分别为5/6：MCPI-5；19/20：MCPI-14；23/24：MCPI-16；25/26：MCPI-17和51/52：MCPI-32。其他31对引物在F1与母本之间未扩增出多态性差异。

图 1　西瓜 F1(左)与母本(右)果实皮色的差异

图 3　西瓜F1及其母本部分SSR引物的筛选结果

2.2.2特异性引物的稳定性检测选出这些在T-1与其母本之间表现出多态性的引物，以母本、父本和F1代子叶DNA为模板，进行多次扩增，验证这些引物扩增的稳定性和可重复性，结果见图4。图4中出现了2种扩增类型，一种是互补类型，即F1代扩增出父母本的互补条带，这种类型既可以区分母本，又可以鉴别父本，如引物MCPI-17；另一种为偏父型，只能鉴别母本而不能区别父本，可以用于鉴别假杂交(母本自交植株)，如MCPI-5、MCPI-14、MCPI-16和MCPI-32。经多次扩增，显示MCPI-5、MCPI-16、MCPI-17 3对引物稳定性好，可重复性强，且非特异性条带较少，而MCPI-14和MCPI-32 2对引物非特异性条带太多，鉴定效果较差。

2.2.33对SSR引物对西瓜种子纯度的鉴定利用MCPI-5、MCPI-16和MCPI-17 3对引物分别对西瓜杂交组合T-1进行种子纯度鉴定，结果(图5)显示，杂交种和假杂种的扩增条带出现明显差异，MCPI-5引物清晰地鉴定出假杂种3和13号，MCPI-16鉴定出的假杂种为7号，MCPI-17鉴定出的假杂种为5和12号。3对引物可以达到鉴别真假杂交种的目的。

图 4　不同引物在西瓜杂交种T-1及其亲本之间扩增的稳定性检测

图 5引物MCPI-5 (A)、MCPI-16 (B)和MCPI-17 (C)对西瓜杂交组合T-1种子纯度的检测结果

Fig.5Identification of seed purity of watermelon hybrid T-1 based on MCPI-5 (A),MCPI-16 (B) and MCPI-17 (C)

2.2.4西瓜种子纯度田间种植鉴定与室内SSR鉴定结果的比较对田间鉴定过的西瓜父本、母本、杂交种和假杂种的叶片统一编号，在实验室再进行SSR种子纯度的重复鉴定，比较田间调查结果与室内鉴定结果的一致性。田间鉴定结果中假杂种分别为9，42，67，107，175和231号，与实验室用MCPI-5和MCPI-16 2对引物鉴定的结果可以对应(图6和图7为部分鉴定结果)。田间和室内鉴定的假杂种同为6株，种子纯度为97.75%，误差为0，2种鉴定结果完全一致。

图 6　引物MCPI-5对西瓜杂交种种子纯度的鉴定结果

图 7　引物MCPI-16对西瓜杂交种种子纯度的鉴定结果

3讨论

在一定隔离条件下的制种地，从母本植株上采得的种子除想得到的F1种子外，就是母本自交种子即假杂种(由于隔离不好，有外来花粉传入而形成的异株型，或因收获时机械混杂造成的异品种种子混入另当别论，本研究仅涉及在规范的繁种条件下种子纯度的检验方法)。因此，种子纯度鉴定就是找出母本与F1的差别，然后利用这一差别鉴别出假杂种所占的比例，计算出种子纯度。

目前西瓜杂交种子纯度鉴定的主要方法仍然是田间鉴定[10]，即利用苗期植株上的差异或开花坐果后幼果的差异进行鉴定[11]。一般苗期鉴定得花费数周时间，时间的长短依苗期表现性状出现的迟早而定。该鉴定方法相对果实鉴定法用时短、耗费少(可密植)，但用于鉴定的标记性状太少，仅对少数品种有效。而利用果实性状鉴定种子纯度是当前大多数西瓜品种鉴定所采用的方法[12]，一般得耗费2个月左右的时间。

杂交种子纯度的室内鉴定是改进田间鉴定耗时费力等不足的最好方法。研究表明，种子纯度的室内鉴定可以利用种子贮藏蛋白、同工酶、DNA等的差别来进行[13-15]。李丽等[16]、赵建华[17]、闫鹏[18]曾对西瓜、甜瓜种子贮藏蛋白和同工酶用于种子纯度鉴定进行了研究，结果显示西瓜种子贮藏蛋白和同工酶差异较小、蛋白质条带不清晰，应用于杂交种子纯度鉴定的准确性较为有限。因此，利用DNA分子标记鉴定西瓜种子纯度成为人们研究的方向。西瓜的遗传基础十分狭窄，国内育出的很多杂交种的亲本材料本身遗传变异幅度小，不易找到多态性差异。因此，找到能够区分杂交种和父本、母本且具有互补带型的合适SSR引物至关重要[19]。

本试验结果表明，利用SSR技术建立种子纯度的室内检测方法是可行的，但筛选出来的引物的扩增产物大小比较接近，多重PCR扩增结果尚不是很理想，所以在进一步的研究中，应该筛选一些扩增产物大小相差大、互相之间无影响的引物进行多重PCR扩增。同时，应建立一个标准化的检测程序，主要包括种子DNA提取、特异性引物筛选、多重PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶识别软件对条带的读取、数据的分析和统计、鉴定结果的形成等。因此，该技术在生产中极具应用潜力，但尚有待进一步的改进和完善。

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Purity identification of watermelon hybrid combination T-1 seeds using SSR molecular marker

JIANG Li-li,ZHANG Gao-yuan,ZHANG Jian-nong

(CollegeofHorticulture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China)

Abstract:【Objective】 SSR molecular marker technique was used to identify purity of watermelon hybrid seeds,aiming to provide a reliable indoor method for purity identification of hybrid seeds.【Method】 Seeds of watermelon hybrid combination T-1 and its parents (P-1,M-13) were selected in this study.DNA was extracted with CTAB method in cotyledon and optimized with SSR molecular marker method.SSR identification results were compared with field identification.【Result】 Three pairs of primers,which were stability,repeatability and polymorphic between hybrids and their parents,were selected from 36 pairs of SSR primers.A total of 267 seedlings of T-1 were identified by MCPI-5 and MCPI-16,the obtained purity was 97.75%,identical to field identification.【Conclusion】 Three pairs of SSR primers (MCPI-5,MCPI-16 and MCPI-17) could be used to identify the seeds purity of T-1.

Key words:watermelon;hybrid seed;purity of seeds;SSR marker

DOI：网络出版时间:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.014

[收稿日期]2014-10-31

[基金项目]甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-202-23)

[作者简介]蒋莉莉(1987-)，女，甘肃榆中人，在读硕士，主要从事蔬菜育种与种质资源利用研究。E-mail：jliabc@163.com [通信作者]张建农(1958-)，男，陕西西安人，研究员，博士，博士生导师，主要从事蔬菜育种与种质资源利用研究。

[中图分类号]S651.037

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)06-0093-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.028.html