黄德超，任强，刘蓉，胡淑芬，张重文，张世杰，黄德娟*

1.东华理工大学，江西 南昌 330013；2.暨南大学理工学院，广东 广州 510632



纳米银污染对蚕豆根尖微核率影响及评价研究

黄德超1，任强1，刘蓉2，胡淑芬1，张重文1，张世杰1，黄德娟1*

1.东华理工大学，江西 南昌 330013；2.暨南大学理工学院，广东 广州 510632

摘要：近年来国际上对银系抗菌材料的研究非常活跃，甚至提倡用纳米粒子净化水源。但水体中纳米银浓度达到何种程度会对生物细胞产生危害至今未见相关研究报道。本文利用蚕豆（Vicia faba L.）根尖微核技术研究水体中纳米银的遗传毒性，以期为纳米银的生态安全评价提供理论依据。将不同浓度的纳米银溶液对蚕豆根尖细胞微核率进行了多重比较，以P＜0.01作为差异有显著统计学意义的判断标准来确定纳米银浓度差异的显著性。并根据《全国生物技术监测规范——蚕豆根尖微核技术》所规定的污染指数划分标准，就蚕豆根尖对水体中纳米银污染程度进行评价。当水体中纳米银质量浓度为5 μg·mL-1时，微核率3.33‰，污染指数1.11，该纳米银质量浓度与空白对照组无极显著性差别，参考污染指数划分标准和评价方法，为基本无污染；当水体中纳米银质量浓度为50 μg·mL-1时，微核率为4.67‰，污染指数1.56，污染程度为轻度污染。随水体纳米银含量的增加，蚕豆根尖微核率和污染指数逐渐加大。当纳米银质量浓度为100和150 μg·mL-1时，微核率分别为6.67‰和10.67‰，污染指数分别为2.22和3.56，污染程度分别为中度污染和重度污染。多重比较显示，虽然纳米银质量浓度分别为5和50 μg·mL-1在微核率上差异未达极显著水平，但纳米银质量浓度50 μg·mL-1与空白对照组相比差异已经达极显著了。据此推断，当水体中纳米银质量浓度超出50 μg·mL-1时，会对生物细胞产生毒性效应。

关键词：纳米银；蚕豆根尖细胞微核技术；微核率；污染指数；差异显著性

引用格式：黄德超，任强，刘蓉，胡淑芬，张重文，张世杰，黄德娟.纳米银污染对蚕豆根尖微核率影响及评价研究［J］.生态环境学报，2016，25（4）:711-714.

HUANG Dechao，REN Qiang，LIU Rong，HU Shufen，ZHANG Chongwen，ZHANG Shijie，HUANG Dejuan.Research on the Influence and Evaluation of Nano-silver Pollution on the Micronucleus Rate of the Root Tip of Vicia Faba ［J］.Ecology and Environmental Sciences，2016，25（4）:711-714.

微核（Evans et al.，1959）是指位于细胞浆中独立于主核的小核。主要由外界损害因子作用细胞后，导致细胞染色体断裂或丢失并在细胞浆中形成1个或数个小核。微核发生的频率与染色体变异的频率密切相关，因此微核出现频率是评价染色体损伤的重要指标之一（Evans et al.，1959；张平等，2008）。蚕豆（Vicia faba）根尖微核（micronucleus，MCN）技术（国家环保总局，2002）是一项检测化学物质对生物毒害的遗传毒理学方法，在环境污染监测和致突变剂检测研究中得到了广泛应用，其检测结果与动物实验结果具有很高的一致性（庞宏等，1996）。

纳米银（Nano-silver）是将粒径做到纳米级的金属银单质。近年来国际上对银系抗菌材料的研究非常活跃，甚至提倡用纳米粒子净化水源，因为纳米银粒子具有较强的抗菌杀菌能力，细菌对其无抗药性。但有实验表明，纳米银可以通过植物积累进入食物链（彭小凤等，2014），还能够透过生物膜上的孔隙进入细胞或者线粒体、细胞核等细胞器内（程海娇等，2014）。那么，水体中纳米银浓度达到何种程度会对生物细胞产生危害？至今尚未见相关研究报道。

由于蚕豆根尖微核率与重金属、生物碱等的毒性具有较好的相关性。本文利用蚕豆根尖微核技术检测了水体中纳米银的细胞遗传毒性，并将纳米银在水体中的浓度按照不同污染级别进行了划分，以期为制定我国农田灌溉水、饮用水及有关生产厂家或使用厂家排放污水中纳米银安全标准提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

青皮蚕豆（Vicia faba L.，2n=12），购于江西省南昌市新建菜市场；

纳米银（JDGKP-003，晋大纳米科技有限公司）。

1.2供试污染物

用蒸馏水将纳米银（本实验采用的纳米银是纳米银氧化锆混合物，含氧化锆95%、纳米银5%）分析纯试剂配成5、50、100、150 μg·mL-1的浓度；另设蒸馏水作为对照（CK）组。

1.3蚕豆处理

蚕豆在25 ℃恒温箱中浸种30 h后催芽，初生根长至2～3 cm，选取发育良好，根尖长短粗细一致的种子置于纳米银处理溶液中浸泡根尖，染毒24 h；将染毒种子洗净后置培养箱中恢复培养24 h；卡诺固定液固定蚕豆根24 h；蒸馏水浸洗两次，1 mol·L-1的盐酸在60 ℃水解10 min左右，直至根尖软化；蒸馏水浸洗两次，碱性品红染色10 min，加盖玻片压片。在Olympus数码显微镜（B103重庆奥特光学仪器有限公司）下镜检观察并拍照。

1.4微核计数标准

每处理选择6～7个根尖，每个根尖随机挑选3个视野，每个切片至少观察1000个细胞，共观察9组，每组3个平行，观察有丝分裂情况，记录微核数。微核标准：直径小于主核大小1/3的微核，染色体结构和颜色深浅相似于主核的微核，形态有圆形、卵圆形、不规则形，不与主核相连，形态完整，不堆叠，轮廓清晰（张平等，2008；段昌群等，1995）。

1.5统计分析

微核率：MCN=微核总数量/根尖细胞总数×100‰

将各个实验组平均微核率的均数与阴性对照组的平均微核率均数进行比较，采用卡方检验，以P＜0.01作为差异有显著统计学意义的判断标准来确定其差异的显著性（程海娇等，2014）。所有实验数据经Excel建立数据库，采用SPSS进行统计分析。

2　实验结果

不同浓度纳米银溶液处理蚕豆根尖24 h后，蚕豆细胞微核率随着处理浓度的增大而增大。将各实验组同对照组进行比较，作χ2检验，并将各实验组与对照组进行显著性差异检测，处理组的P值均小于0.01，存在极显著性差异（叶子弘等，2011）。说明处理24 h后，纳米银溶液浓度越大，对细胞有丝分裂的影响越大。

表1显示：蚕豆根尖处理24 h后，纳米银浓度过大时有些根尖受到严重损伤，影响平均微核率增加。将各实验组同对照组进行χ2检验，并将各实验组与对照组进行显著性差异检验，其中，5个不同浓度处理的P值均小于0.01，存在极显著性差异（段昌群等，1995）。

表2显示：当P＜0.01时，对照组（0）与（1）组、（1）组与（2）组之间无极显著性差异；其余各组之间均存在极显著差异。

3　蚕豆根尖对水体中纳米银污染程度的评价

根据《全国生物技术监测规范——蚕豆根尖微核技术》（叶子弘等，2011）所规定的污染指数划分标准，采用污染指数（PI）值来划分所受污染的程度值。

3.1评价方法

污染指数（PI）=样品实测MCN平均值/标准（对照值）MCN平均值（王勇等，2008）

3.2评价标准

工业废水蚕豆根尖微核污染等级标准如表3所示。

3.3评价结果

表4显示，水体中纳米银质量浓度为5和50 μg·mL-1时，微核率分别为3.33‰和4.67‰，污染指数分别为1.11和1.56，参考污染指数划分标准（表3）和评价方法，污染程度分别为基本无污染和轻度污染。随水体纳米银含量的增加，蚕豆根尖微核率和污染指数逐渐加大。当纳米银质量浓度为100 和150 μg·mL-1时，微核率分别为6.67‰和10.67‰，污染指数分别为2.22和3.56，污染程度分别为中度污染和重度污染。

4　讨论

表1　处理24 h后，不同浓度的纳米银溶液对蚕豆根尖细胞微核率的影响结果Table 1 The effect of different concentrations of nano-silver solution on the micronucleus rate of Vicia faba’s root tip （24 hours’ result）

通过进行不同浓度的纳米银对蚕豆根尖细胞诱导的微核效应的实验，结果表明：当水体中纳米银质量浓度为5 μg·mL-1时基本无污染，当纳米银质量浓度是50 μg·mL-1时为轻度污染，水体中纳米银浓度是100 μg·mL-1时为中度污染，水体中纳米银质量浓度为150 μg·mL-1时为重度污染。虽然纳米银质量浓度分别为5和50 μg·mL-1时蚕豆根尖微核率差异未达到极显著水平，但纳米银浓度50 μg·mL-1与空白对照组相比差异已达极显著水平。据此推断，当水体中纳米银浓度超出50 μg·mL-1时，会对生物细胞产生毒性效应。

蚕豆是微核技术检测常用的材料，通过纳米银溶液对蚕豆根尖诱导的微核效应的研究，可以检测到纳米银对机体存在着潜在的遗传危害。该项研究方法适合对受纳米银污染的水体样品的检测和监控。

致谢：教育部“长江学者和创新团队发展计划”（Supported by Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University）！

表2　处理24 h后，不同浓度的纳米银溶液对蚕豆根尖细胞微核率的组间多重比较Table 2 24 hours’ Micronucleustest result of Vicia faba’s root tip with different concentrations of nano-silver solution

表3　工业废水蚕豆根尖微核污染等级标准（王勇等，2008）Table 3 Class of Industrial wastewater’s pollution based on Vicia faba’s root tip Micronucleustest

表4　蚕豆根尖对纳米银污染水体的检测评价Table 4 Evaluation of water’s pollution with Vicia faba’s root tip via Nano-silver solution

参考文献：

EVANS H J，NEARY G J，WILLIAMSON F S.1959.The re1ative biological efficiency of single doses of fast neutrons and gamma-rays on vicia faba roots and the effect of oxygen.Part Ⅱ.Chromosome damage:the production of micronuclei ［J］.International Journal of Radiation Biology，1（3）:216-229.

程海娇，吴永军，彭雪玲，等.2014.纳米银的毒理学研究进展［J］.食品安全质量检测学报，（11）:3537-3541.

段昌群，王焕校.1995.重金属对蚕豆的细胞遗传学毒理作用和对蚕豆根尖微核技术的探讨［J］.植物学报:英文版，32（1）:14-24.

国家环保总局.2002.水和废水监测分析方法（第4册）.［M］.第4版.北京:中国环境科学出版社:769-772.

庞宏，路亚北，陆汉祥.1996.玄武湖水、金川河水诱发的蚕豆根尖细胞微核［J］.南京师范大学学报（自然科学版），19（4）:52-55.

彭小凤，朱敏，任洁，等.2014.纳米银的植物毒性研究进展［J］.生态毒理学报，9（2）:199-204.

王勇，张和平.2008.蚕豆根尖微核技术在污染源废水监测中的应用研究［J］.环境保护与循环经济，28（7）:45-46.

叶子弘，陈春主编.2011.生物统计学［M］.北京:化学工业出版社:1-268.

张平，汪珍春，姚焱，等.2008.蚕豆根尖微核技术研究水体中铊的遗传毒性［J］.生态环境，17（1）:47-49.

张平，汪珍春，姚焱，等.2008.蚕豆根尖微核技术研究水体中铊的遗传毒性［J］.生态环境，17（1）:47-49.

Research on the Influence and Evaluation of Nano-silver Pollution on the Micronucleus Rate of the Root Tip of Vicia Faba

HUANG Dechao1，REN Qiang1，LIU Rong2，HU Shufen1，ZHANG Chongwen1，ZHANG Shijie1，HUANG Dejuan1
1.State Key Laboratory Breeding Base of Nuclear Resources and Environment，East China Institute of Technology，Nanchang 330013，China；2.College of science and engineering at Jinan University，Guangzhou 510632，China

Abstract：Research on the silver antimicrobial material is very active in recent years，and even promoted the use of nanoparticles to purify water.But how much water nano-silver concentration would cause harm to biological cells has not been reported in studies yet.In this paper，we studied the genetic toxicity of nano-silver in the water by applying the micronucleus technique on the root tip of Vicia faba to provide theoretical basis for evaluating ecological security.By applying different concentrations of nano-silver solution on the root tip of Vicia faba and comparing the micronucleus rate，using P ＜ 0.01 as a criteria that has statistical significance to determine the significance of the differences of nano-silver concentrations.According to the pollution index criteria standard defined in “National Biotechnology monitoring standards micronucleus technology of root tip of Vicia faba”，we evaluated the degree of pollution of the root tip of Vicia faba in nano-silver solution.The result shows that if the nano-silver solution is 5 µg·mL-1，the micronucleus rate will be 3.33‰，and the pollution index could be 1.11，that is，almost unpolluted，it is conclude that little significant difference can be found between that and the control group； If increase the concentration of nano-silver solution to 50 µg·mL-1，the micronucleus rate will be 4.67‰ with the pollution index of 1.56，which is，lightly polluted.While increasing the content of nano-silver solution，the micronucleus rate and the pollution index of the root tip of Vicia faba gradually increases.When the nano-silver's concentration is 100，150 µg·mL-1，the micronucleus rate is respectively 6.67‰，10.67‰ and the pollution index is 2.22 （moderately polluted），3.56 （heavily polluted），respectively.Multiple comparsion shows that although the difference of micronucleus rate is not significant when the concentration is 50 µg·mL-1compared to 5 µg·mL-1，the difference is outstanding and statistically significant （P＜0.01） if compared to the controlled group.Thus，we can conclude that toxicity can affect cells when the concentration of nano-silver in water reaches 50 µg·mL-1or higher.

Key words：nano-silver； vicia faba；root tip cells’ micronucleus technique； micronucleus rate； pollution index； statistical significance

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.023

中图分类号：X171.5

文献标志码：A

文章编号：1674-5906（2016）04-0711-04

基金项目：抚州市科技局科技专项项目（抚赣教指［2014］69号）；国家自然科学基金项目（41361088）

作者简介：黄德超（1960年生），男，副教授，目前主要从事纳米银环境污染治理研究

*通信作者：黄德娟，女，教授，目前主要从事重金属环境污染治理研究

收稿日期：2016-01-15